Biotransformación

De un tiempo a hora y más concretamente en la última década, en el mundo cervecero se ha empezado a hablar mucho sobre la biotransformación.

A nivel casero la biotransformación nos queda muy inalcanzable y se ve como un futuro muy lejano.

Antes de empezar a desglosar que aporta la biotransformación a la cerveza veamos en sí que es este proceso.

En el gran sentido de la palabra, la biotransformación es el proceso mediante el cual un organismo vivo modifica una sustancia química, transformándola en otra diferente.

Como vemos, es una definición muy extensa y que abarca muchos campos.

Pero si lo trasladamos a la elaboración de cerveza podemos decir que tenemos una biotransformación en la misma fermentación.

Es decir, un organismo vivo «Saccharomyces Cerevisiae» transforma una sustancia química «azúcar» produciendo otro distinto «alcohol».

Cuando los cerveceros empezaron a utilizar lo que hoy conocemos como Dry Hopping (añadir lúpulo después de la fermentación) notaban que la cerveza recién elaborada tenía sabores provenientes de los lúpulos, pero que cuando esta cerveza se maduraba durante unos meses esos sabores y aromas se transformaban dando otros perfiles.

Esto viene dado porque al embotellar la cerveza aún conteniendo levadura viva, se producía una nueva biotransformación.

En unos primeros estudios se sabía que hay una biotransformación en la maduración de la cerveza artesana.

El llevar a cabo un estudio en profundidad, en unos laboratorios específicos era muy costoso y difícilmente podían permitírselo.

Todo tiene un comienzo.

El aumento en los estudios de la biotransformación en la cerveza se ha producido en la última década y toda esta investigación ha sido de forma empírica.

Este aumento viene dado por el gran auge que ha tenido un nuevo estilo de cerveza llamado New England IPA, donde es frecuente el dry hopping realizado durante la etapa activa de la fermentación.

Esta adición temprana de lúpulo, es puesta en práctica de casualidad por Jean Broillet IV fundador de Tired Hands, que al intentar acortar los plazos en la producción añadía el Dry Hop al tercer o cuarto día de fermentación.

Los efectos de esta adición temprana fueron evidentes aumentando el sabor y el componente aromático del lúpulo.

Broillet dice «fue este atajo el que nos produjo un mejor costo-beneficio, consecuencia de intentar acortar los tiempos de producción».

El lúpulo está expuesto a la levadura cuando aún estaba fermentando el mosto, es decir en fermentación activa.

Con lo cual la levadura transformaba los aceites esenciales de los lúpulos en otros, aportando a la cerveza más carácter del lúpulo añadido tanto en sabor como en aroma, con una pequeña casi inapreciable aportación de amargor.

Entrando un poco más en profundidad en lo que hace la levadura activa al encontrarse con el lúpulo y hacer la biotransformación de algunos de sus componentes, podemos decir que nos podemos encontrar con:

• Ésteres: El éster viene dado por la unión de un alcohol y un ácido. Dándonos olores a manzana, frutos rojos, peras, etc.
  En la biotransformación podemos encontrar aromas a rosas, proveniente de la transformación del geraniol un compuesto orgánico producido por el lúpulo.
• Glucósidos: El glucósido viene dado por la unión de un azúcar y un compuesto aromático.
  En la biotransformación la levadura mediante una enzima divide los glucósidos liberando las moléculas aromáticas, aumentando de esta manera la percepción aromática en la cerveza.
• Tioles: El tiol es un compuesto sulfuroso que podemos encontrar de dos formas, libres o adheridos.
  En los adheridos el factor aromático, lo podemos encontrar vinculados a aminoácidos o péptidos en lugar de azúcar, actuando de la misma forma que los glucósidos al encontrarse con la levadura.
  Los libres son un compuesto muy potente que puede ser perceptible por el olfato humano en proporciones de cinco partes por millón.
  En la biotransformación lo podemos detectar porque da aromas a frutas tropicales, orín de gato o sudor.

Pérdida de compuestos aromáticos

La pérdida de aroma en la biotransformación es debido a la parte hidrofóbica de los compuestos de la levadura y del lúpulo.

Al estar la levadura y el lúpulo en contacto se adhieren unos a otros, siendo más propensos a ser absorbidos por las paredes celulares de la levadura.

Con esta reacción se pierde el componente aromático en la cerveza.

También se pueden dar pérdidas de aroma en la fermentación activa, a consecuencia de la producción de dióxido de carbono por la levadura.

Este dióxido arrastra los componentes más volátiles de los aceites del lúpulo expulsándolos fuera del fermentador.

Concluyendo.

Como vemos los factores de la biotransformación en la fermentación depende de cada compuesto existente y la cantidad que contenga cada lúpulo y cada levadura.

Incluso en el caso de los lúpulos estas cantidades varían incluso de una cosecha a otra.

A día de hoy se conocen unos 500 componentes en el lúpulo, y se supone que tiene más de mil.

Teniendo en cuenta estos factores nos encontramos todavía con un mundo inexplorado.

Y que científicamente o con datos exactos no podemos concretar, que tanto influye la biotransformación en el resultado final de la cerveza.

Todo esto está unido al gran costo que supone para las cerveceras el poder analizar cada compuesto tanto del lúpulo como de la levadura.

Y que cada lúpulo y levadura varían en sus compuestos dando resultados distintos.

Raíz Cúbica de Juguetes Perdidos es una belgian Pale Ale de Abadía, madurada con lúpulo Stiryan Goldings y refermentada con Brettanomyces lambicus. Está lupulada con un dry hop bastante fuerte de Styrian Golding en tanques horizontales durante 3 semanas con la adición de una cepa de Brett Claussenii con una dosis pequeña de azúcar y Brettanomyces que se comen los azúcares más complejos que todavía quedaron de la primera fermentación.

Tiene 5 volúmenes de anhídrido carbónico, es una cerveza súper efervescente y con una espuma muy persistente que evoluciona muy bien con el tiempo.

Se lanza con 6 meses de añejamiento porque todavía se percibe la frescura del lúpulo y, además, ya se empieza a notar el Brett; al principio es más lupulada y después se empieza a secar y a secar.

https://www.lamalteriadelcervecero.es/biotransformacion-en-la-cerveza/
https://www.mundocerveza.com/raiz-cubica-lo-nuevo-de-juguetes-perdidos/

En qué Momento hacer Dry Hop

Autor: Sebastián Oddone

Hay muchas opiniones al respecto, todas con sus fundamentos. Se habla de ventajas, desventajas según el momento, la actividad de la levadura, la temperatura, el riesgo de ingreso de oxígeno, el tiempo de contacto del lúpulo con la cerveza.

Tomando como ejemplo el caso de llevar a cabo un único dry hop y con la tecnología de un cervecero casero, se podrían plantear varios escenarios posibles:

1) Al inicio de la fermentación es decir día 1 o 2. Aquí el oxígeno que puede llegar a ingresar al abrir la tapa para hacer el DH sería absorbido por la levadura, minimizando riesgos de oxidación. Se perderían ciertos aceites del lúpulo por efecto de arrastre por el CO2 generado por la levadura. Esto último podría ser positivo o negativo, dependiendo el perfil de aroma que se busque. Por otra parte, la actividad de la levadura podría dar lugar a ciertas reacciones de biotransformación y su consecuente aporte en complejidad aromática.

2) Antes de finalizar la fermentación primaria, día 3 a 5. La situación es similar a la del caso 1, ya que la levadura aún tendrá cierta actividad. Lo bueno este momento es que el nivel de CO2 generado es bajo y el efecto del streeping será menos significativo.

3) Durante la maduración en caliente, día 6 a 9 aprox. La ventaja en este caso es quizás la mayor temperatura que puede tener el mosto, si es que elevamos la temperatura para una maduración más efectiva. A mayor temperatura, mayor la extracción de aceites. Sin embargo, la baja actividad de la levadura podría dejar oxígeno sin absorber y más riesgo de oxidación futura.

4) Durante la etapa de clarificación/maduración en frío. Los aromas desarrollados por el lúpulo son más frescos, más “herbales” quizás, debido a la solubilización de algunos aceites de hidrocarburos volátiles. El frío los mantiene mejor en solución. Sin embargo, en frío la extracción es más lenta y también se incrementa el riesgo de oxidación.

5) Incorporar en el barril dentro de una bolsa de dry hop. Podrían obtenerse aromas muy frescos. Previene mejor el riesgo de oxidación. Pero podría causar astringencia y flavors vegetales si no se consume en poco tiempo la cerveza.

Mi opinión basada en la experiencia personal y también en las opiniones de cerveceros que considero con mayor nivel de fundamentación, el segundo método, en caso de programar un único dry hop, es el que daría mejores resultados. Aunque claramente no está todo dicho, hay mucho por probar e investigar al respecto. Las variables son muchas, y sus efectos también.

https://www.facebook.com/sebastian.oddone.9/posts/3989461804468943

Biotransformación del Lúpulo

Autor: Sebastián Oddone

Cuando la levadura provoca algún tipo de cambio químico en el lúpulo o sobre alguno de sus componentes, se dice que ocurre “biotransformación”. Una de las consecuencias de la biotransformación es la diferencia en los perfiles de aroma que se generan durante un “Dry Hop”. Si la levadura va a tener algún tipo de efecto sobre el lúpulo, luego no es lo mismo si se adiciona lúpulo en momentos en los que la fermentación es activa, o bien luego de finalizada la misma.

Es un fenómeno muy estudiado en los últimos años que involucra diferentes reacciones. Es decir, la biotransformación puede ser de varios tipos, y se pueden clasificar en las siguientes categorías:

A) Clivaje glicosídico. Un glicósido es una molécula que tiene potencial de aroma. Es una combinación de un azúcar con otro precursor, que inicialmente no ofrece ningún aroma, sin embargo, cuando es cortado (clivado) por la enzima beta-glucosidasa presente en algunas cepas de levadura, permite la liberación de terpenos de alcohol y su consecuente flavor asociado.

B) Transformación de terpenos de alcohol. La conversión de un compuesto del lúpulo denominado geraniol en otros compuestos como el nerol, linalol, citronelol es un ejemplo de biotransformación. También puede ser causado por la levadura, brindando una complejidad diferente en el perfil de aromas de la cerveza.

C) Liberación de tioles. Los tioles son compuestos de azufre que tienen un alto potencial de aroma con un muy bajo umbral de detección. Sus perfiles son de frutas tropicales, cítricos, sauvignon blanc, entre otros. Los tioles presentes en los lúpulos pueden estar en forma libre o ligados a aminoácidos. Algunas cepas de levadura son capaces de liberar tioles ligados, a través de una enzima que se llama beta-liasa, incrementando los perfiles de aroma.

Lallemand ha caracterizado sus cepas y ha publicado cuales de ellas tienen mayor actividad beta-glucosidasa, responsable del clivaje glicosídico. No sorprende que dichas cepas sean la BRY97, la Belle Saison y la New England.

En definitiva y a modo de conclusión está demostrado que ciertas cepas de levadura son capaces de modificar los aportes de los lúpulos, y será el cervecero quien tome la decisión sobre qué levadura utilizar y el timing  de lupulado en función del objetivo que tenga sobre su producto.

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Levaduras no convencionales como herramientas de innovación y diferenciación en la producción de cerveza

• Las levaduras no convencionales muestran gran potencial para la innovación cervecera.
• La caracterización de nuevos microorganismos para el sector cervecero está en constante revisión.
• El bioflavoring es una cualidad altamente buscada en las levaduras no convencionales.
• Las cervezas NABLAB, de bajas calorías y funcionales, son tendencia actual en el mundo.
• Las levaduras nativas patagónicas muestran atributos promisorios para el sector.

Resumen

En la elaboración de cerveza las levaduras cumplen un rol fundamental. Además de ser responsables de llevar a cabo la fermentación, generando principalmente etanol y dióxido de carbono, también son capaces de metabolizar y producir numerosos compuestos orgánicos que tienen un impacto determinante en el aroma y el sabor final de la cerveza. Las especies Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pastorianus son utilizadas tradicionalmente para la producción de cervezas ale y lager, respectivamente. No obstante, el continuo crecimiento en el mercado de la cerveza artesanal y el aumento del interés y las exigencias de los consumidores han orientado los esfuerzos hacia la producción de cervezas diferenciales e innovadoras. En este punto, las levaduras no convencionales han cobrado gran protagonismo como herramientas para el desarrollo de nuevos productos. En el presente trabajo se describe y desarrolla la potencial aplicación en el sector cervecero de diferentes especies de levaduras no convencionales pertenecientes a los géneros Brettanomyces, Torulaspora, Lachancea, Wickerhamomyces, Pichia y Mrakia, entre otras, así como también levaduras del género Saccharomyces distintas a las levaduras cerveceras tradicionales. Se detallan las condiciones de fermentación de este tipo de levaduras y su capacidad de asimilar y metabolizar diferentes componentes del mosto y de aportar características particulares al producto final. Este trabajo provee el estado del arte sobre levaduras no convencionales, lo que resulta de gran relevancia para evaluar su aplicación en la producción de cervezas artesanales con características sensoriales diferenciales, cervezas bajas en calorías, cervezas sin alcohol y cervezas funcionales.

Introducción

La cerveza es la bebida alcohólica de mayor consumo a nivel mundial y su elaboración comprende la fermentación, mediada por levaduras, de un mosto obtenido a partir de granos (generalmente, de cebada) malteados, al que se le incorpora lúpulo73. Uno de los principales criterios de clasificación de los cientos de estilos diferentes de cerveza existentes se basa en el tipo de fermentación y, por lo tanto, en el tipo de levadura involucrada. Las levaduras cerveceras se clasifican, principalmente, en aquellas de fermentación alta (ale o top fermenting yeasts) y baja (lager o bottom fermenting yeasts). Las primeras se emplean para fabricar cervezas ale, que son producidas con cepas domesticadas de la especie Saccharomyces cerevisiae, en un proceso que ocurre generalmente entre los 18 y 24 °C, y se suelen caracterizar por una complejidad de aromas y sabores frutales, florales o especiados. Por su parte, las cervezas de fermentación baja (cervezas lager) se producen utilizando la especie híbrida Saccharomyces pastorianus (S. cerevisiae x Saccharomyces eubayanus) a temperaturas bajas, entre 5 y 15 °C, y resultan sensorialmente más neutras; S. pastorianus, además exhibe alta resistencia a diversos factores de estrés, lo que la hace muy útil para la producción de cerveza a nivel industrial40, 85.

La cerveza lager representa hoy más del 90% de la producción mundial de cerveza, aunque el rápido crecimiento de la producción a escala artesanal, en la que se utilizan en mayor proporción levaduras ale, puede modificar sensiblemente estos valores en el futuro cercano. Existen en la actualidad otros estilos de cervezas particulares y de menor incidencia, como las cervezas lámbicas, de origen belga, que mantienen sistemas fermentativos más antiguos y son una muestra actual de cómo se hacía cerveza históricamente, en lo que refiere a la fermentación. Estas cervezas surgen de un proceso de fermentación espontánea llevado a cabo por microorganismos residentes en las propias cervecerías, que se incorporan al exponer el mosto en tanques abiertos al enfriarse durante la noche, antes de ser transferido a barricas de madera para su posterior fermentación y maduración20, 88, 89. Múltiples especies de levaduras y bacterias se desarrollan durante este proceso de fermentación espontánea, que consta de distintas fases: una fase inicial, donde predominan las enterobacterias y algunas levaduras no sacaromicéticas (como Hanseniaspora, Naumovia, Kluyveromyces, Rhodotorula y Pichia spp.), una fase de fermentación alcohólica principal, liderada por levaduras del género Saccharomyces, seguida de una fase ácida llevada a cabo por bacterias ácido lácticas (BAL), y, en menor medida, bacterias ácido acéticas (BAA); finalmente, el nicho es ocupado por levaduras del género Brettanomyces, que predominarán en la maduración durante meses o años aportando a la complejidad de aromas y sabores de estos estilos de cerveza88, 89.

Desde la segunda mitad del siglo xix, esta forma antigua de fermentación espontánea comenzó a restringirse al establecerse el concepto de fermentaciones controladas, llevadas adelante mediante la inoculación del mosto con cultivos iniciadores de levaduras específicas85. Estas levaduras cerveceras fueron evolucionado a través de procesos de selección natural y artificial, y llevaron a la generación de cepas altamente especializadas y adaptadas (proceso de domesticación)26. Los desarrollos microbiológicos que tuvieron lugar en esa época, en particular, el uso de cultivos de levadura pura iniciados por Christian Hansen en la década de 1880, mejoraron en gran medida la consistencia y calidad de la cerveza, pero limitaron el número de cepas aplicadas a su producción89. Las levaduras cerveceras por excelencia pertenecen al género Saccharomyces y esto se debe, básicamente, a aspectos claves como la producción eficiente de etanol, la ausencia de producción de toxinas (inocuidad), la alta tolerancia al etanol y la capacidad de llevar a cabo la fermentación alcohólica incluso en presencia de oxígeno. Como característica complementaria, se destaca la capacidad de producir compuestos de flavor, que aportan perfiles organolépticos deseables a la cerveza85, 89. En este trabajo se utilizará la palabra flavor para designar la combinación de aromas, sabores y sensaciones percibidos en la boca.

Aunque el etanol, el dióxido de carbono y el glicerol son los principales compuestos producidos por las levaduras cerveceras durante la fermentación del mosto, en general, dichos compuestos tienen un impacto mínimo en el aroma y sabor; en cambio, es la concentración de los diversos productos metabólicos secundarios lo que determina, principalmente, el balance de flavor de la cerveza26, 75. Estos productos secundarios son intermediarios en vías metabólicas que van desde el catabolismo de los componentes del mosto (azúcares, compuestos nitrogenados y compuestos azufrados) hasta la síntesis de los componentes necesarios para el crecimiento de la levadura (aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos), y corresponden a carbonilos (aldehídos y cetonas), alcoholes superiores (fusel), ésteres, dicetonas vecinales (diacetilo y pentanodiona), ácidos grasos, ácidos orgánicos, compuestos azufrados y compuestos fenólicos (conocidos como POF, phenolic off flavors, fenoles no deseados)75, 91. En trabajos de revisión previos se ha profundizado en los factores que regulan la síntesis de ésteres60 y alcoholes superiores61 en las levaduras cerveceras. Sin duda, los compuestos de sabor y aroma deben mantenerse dentro de ciertos límites o pueden predominar y perjudicar el balance organoléptico de la cerveza75, 91. Además de la amplia gama de productos metabólicos generados por las levaduras, éstas también tienen un rol activo en procesos de biotransformación, ya que son capaces de convertir precursores no volátiles e inodoros (en particular, del lúpulo) en compuestos de flavor, aumentando así el potencial organoléptico del mosto6, 89. Las cepas de levaduras son tan diversas como los aromas y sabores resultantes; por lo tanto, la elección de aquella deberá apuntar a las características organolépticas deseadas en los estilos de cerveza producidos98.

A pesar del uso generalizado de las levaduras cerveceras tradicionales, las levaduras no convencionales han comenzado a ganarse un lugar en las cervecerías. El crecimiento del segmento de cerveza artesanal y el creciente número de consumidores especializados han impulsado la búsqueda de estrategias para la diferenciación productiva, y el papel de las diferentes levaduras como protagonistas en la generación de productos innovadores y con características distintivas ha recibido especial atención30. Generalmente, las levaduras no convencionales presentan bajos rendimientos de fermentación y son más sensibles al estrés por etanol, pero abren un abanico de posibilidades al proporcionar aromas y sabores distintivos, así como nuevos enfoques y características que impactan en el perfil organoléptico de la cerveza6, 68. En el sector de alimentos y bebidas, la producción o el aumento de compuestos de flavor a través de sistemas biológicos se conoce como bioflavoring94; en este contexto, diversas especies de levaduras no convencionales han sido indicadas como agentes factibles para acentuar, mejorar y diversificar las características sensoriales de la cerveza6. El término bioflavoring será utilizado a lo largo de este trabajo de revisión basado en esta capacidad de mejorar, aumentar o diversificar las propiedades organolépticas de flavor (aroma, sabor y sensación en boca). Además del bioflavoring, se han destacado otras aplicaciones a partir de levaduras no convencionales, como la producción de cervezas bajas en calorías, cervezas sin alcohol o bajas en alcohol (non-alcoholic beer and low-alcohol beer sector, NABLAB) y cervezas funcionales20, 30.

Para atender a estas innovaciones de la demanda, se han estudiado e incluso utilizado levaduras que pertenecen al mismo género que las levaduras cerveceras (Saccharomyces), así como también levaduras pertenecientes a grupos taxonómicos distintos de Saccharomyces. Las primeras involucran levaduras industriales de S. cerevisiae, pero domesticadas para otros procesos fermentativos (como cachaça, sake, etc.), o levaduras no domesticadas de otras especies provenientes de ambientes naturales, consideradas salvajes, como, por ejemplo, S. eubayanus. Las segundas comprenden un amplio grupo de especies con capacidad fermentativa que pertenecen, en su mayoría, al filum Ascomycota (de los géneros Brettanomyces, Torulaspora, Lachancea, Hanseniaspora, Saccharomycodes, Zygosaccharomyces, Pichia, entre otros) y, en pocos casos, al filum Basidiomycota (por ej. Mrakia)29.

Dado que actualmente el desarrollo de inóculos comerciales basados en este tipo de levaduras no convencionales se encuentra en fuerte crecimiento, así como su aplicación en cervecerías en busca de productos innovadores, en este trabajo se presenta el estado actual del conocimiento sobre estas levaduras. En la figura 1 se esquematiza la filogenia o relación de parentesco27 entre las distintas especies de levaduras descritas, junto con sus principales características y potenciales aplicaciones en el sector cervecero.

Figura 1. Cladograma de las especies de levaduras no convencionales de interés para el sector cervecero. Las relaciones de parentesco entre las especies están basadas en la publicación de Daniel et al. (2014)27 y datos propios. Se detallan las familias en las que se agrupan las distintas especies de levaduras, junto con las características y aplicaciones más relevantes para su uso en la producción de cerveza.

POF: fenoles no deseados; bioflavoring: producción de cervezas con características de aroma y sabor diferenciales; NABLAB: cervezas sin alcohol o bajas en alcohol; bajas calorías: cervezas con bajo contenido de hidratos de carbono; sour: cervezas ácidas.

* Especies con formato comercial disponible.

● Presentan las características/aplicaciones detalladas.

○ No presentan las características/aplicaciones detalladas.

Las características/aplicaciones detalladas son cepa dependiente. La especie Saccharomyces pastorianus no se encuentra representada debido a que no es una especie biológicamente reconocida por tratarse de un híbrido.

Levaduras no convencionales en la industria cervecera

Actualmente, existen más de 1.500 especies conocidas de levaduras repartidas en los fila Ascomycota y Basidiomycota, de las cuales solo el 30% (la mayoría, Ascomycota) tiene la capacidad de fermentar azúcares simples52. Estudios de más de 100 especies diferentes en los que se evaluó el rendimiento de fermentación y el potencial de producción de compuestos aromáticos (como alcoholes superiores, ésteres de acetato y ésteres de etilo) revelaron que muchas especies de levaduras no convencionales poseen una elevada capacidad para producir diferentes compuestos de flavor, con un buen potencial de aplicación para la producción de cervezas diferenciales36, 67. Los estudios orientados a la selección y la aplicación de levaduras no convencionales en la producción de cerveza, generalmente, estudian características como la utilización de maltosa (principal azúcar del mosto), el desempeño fermentativo, la tolerancia al etanol y a bajas temperaturas, la tolerancia a los compuestos que provienen del lúpulo, la utilización de aminoácidos, la formación de POF y de compuestos de sabor y aroma, y también la síntesis de enzimas que interactúan con el lúpulo (como las β-glucosidasas)26, 67, 92, 96. En pocos años, las levaduras no convencionales cambiaron su papel de microorganismos potencialmente indeseables asociados al deterioro de los alimentos (incluida la cerveza) a agentes claves en el desarrollo de productos innovadores para ganar una posición de mercado en el segmento cervecero85. A continuación, se mencionan los ejemplos más destacados de levaduras no convencionales en investigación o con aplicación en la industria cervecera, agrupándolas como levaduras sacaromicéticas «alternativas» o bien levaduras no sacaromicéticas.

Saccharomyces alternativas

Dentro de las levaduras sacaromicéticas no convencionales se distinguen aquellas pertenecientes a la especie S. cerevisiae, pero que son distintas de las levaduras cerveceras ale. Puede tratarse de cepas de S. cerevisiae provenientes de cervezas con características muy particulares o de regiones geográficas determinadas (por lo que han atravesado trayectorias de domesticación diferentes, por ejemplo, las levaduras farmhouse), o bien de cepas aisladas de ambientes naturales (salvajes) o de otras bebidas tradicionales (por ej. cachaça, chicha, sake)26; asimismo, pueden encontrarse dentro de esta especie variedades con características muy distintas (como S. cerevisiae var. diastaticus). Por su parte, las levaduras sacaromicéticas no convencionales pueden incluir también a especies distintas a S. cerevisiae, como lo es la especie S. eubayanus.

Levaduras farmhouse noruegas

Las levaduras farmhouse son aquellas que se han utilizado en la elaboración tradicional de cerveza en granjas de Europa durante un período de tiempo considerable, y son un ejemplo de levaduras sacaromicéticas no convencionales que sufrieron un proceso de domesticación diferente al de las variedades cerveceras tradicionales37. El caso más novedoso son las denominadas levaduras kveik, de origen noruego, que fueron puestas en escena recientemente por Lars Marius Garshol, un ingeniero de software que pasó cinco años investigando diversos aspectos de la elaboración de cerveza en granjas remotas de Noruega37. Hasta hace poco, los cultivos de levadura conocidos como kveik (un término para «levadura» en el dialecto de la región oeste y sur de Noruega) estaban aislados geográficamente y mantenidos solo localmente por los cerveceros tradicionales. Ellos mantienen y reutilizan las kveik haciendo uso de los famosos yeast logs o yeast rings (elementos de madera agujereada) que, entre producción y producción, se deshidratan al sol80, 95. Gracias a los recientes avances en la tecnología de secuenciación genómica, estudios científicos permitieron hipotetizar que el proceso de domesticación de las levaduras cerveceras tradicionales se aceleró en el período de industrialización; en el caso de las kveik, se sabe que fueron reutilizadas localmente en Noruega desde el siglo xvi y han atravesado un proceso de domesticación diferente80, 95. Esto explica por qué, en un estudio reciente que exploró diez cepas distintas, las kveik fueron reconocidas como un grupo genético y fenotípicamente distinto de levaduras cerveceras tradicionales, con propiedades relevantes para la elaboración de la cerveza26, 80. Los cultivos de kveik son cultivos mixtos que consisten, principalmente, en múltiples cepas diferentes de S. cerevisiae37.

En general, estas levaduras son muy floculantes, con gran tolerancia al etanol, no producen fenoles (POF−), atenúan el mosto dentro del rango esperado para cepas cerveceras domesticadas (65-85% de atenuación97) y exhiben una alta velocidad de fermentación (posiblemente, debido a que los cerveceros noruegos prefieren un corto tiempo de fermentación, a menudo de solo uno o dos días, antes de transferir al barril)37, 80. Las kveik presentan, además, tolerancia a altas temperaturas, característica que se mantuvo en estas levaduras debido a la práctica tradicional de inocular y fermentar mostos a temperaturas altas en relación con los estándares modernos (entre 35 y 40 °C), posiblemente dada por la incapacidad de enfriar el mosto de manera rápida y eficiente38. Así, una característica diferencial es que estas levaduras pueden ser utilizadas en fermentaciones a altas temperaturas sin la producción de off flavors (en particular, de alcoholes superiores)37, 80. Los cerveceros noruegos tradicionales usan una tasa de inoculación mucho más baja que la típica para la producción de cerveza (aproximadamente, del 10% de la tasa de inoculación habitual), incluso en mostos de alta densidad, sin producción de off flavors o cambios sensoriales evidentes81. Inocular a una tasa estándar (0,75-1,5 × 106 cél./mL) puede reducir el aroma, pero puede mejorar el tiempo de fermentación; es recomendable la experimentación en fábrica para determinar qué tasa de inoculación es la óptima para cada producto37. Organolépticamente, las kveik son capaces de producir ésteres en concentraciones por encima del umbral de percepción, que contribuyen al flavor frutado asociado con estas levaduras; entre ellos cabe mencionar el caproato de etilo (ananá, tropical), el octanoato de etilo (ananá, tropical, manzana, coñac) y el decanoato de etilo (manzana), así como el acetato de fenetilo (miel, floral), e incluso, un sabor intrigante (aún no completamente caracterizado) a hongos37. Aún no hay información publicada sobre la capacidad de biotransformación de componentes del mosto por parte de estas levaduras, pero su estudio es inminente; actualmente se están llevando a cabo ensayos sobre su potencial de transformación de terpenos del lúpulo (Preiss R., comunicación personal). La introducción de las kveik en las cervecerías se está convirtiendo en una práctica popular en América y ya es posible acceder a distintas cepas de estas levaduras en formato comercial (tabla 1).

Tabla 1. Levaduras no convencionales más relevantes para la producción de cervezas diferenciales e innovadoras

Especie	Fuente de aislamiento	Aplicaciones	Características	Cepas comerciales	Referencias
Brettanomyces spp.	Fermentaciones espontáneas Contaminante de bebidas alcohólicas	Fermentación primaria y coinoculación Maduración Añejamiento Bioflavoring Cervezas bajas en calorías	Atenuación: > 90% Flavor: especiado, tropical, pera, uva, Brett flavor POF: positiva (VPR) Tolerancia a estrés: etanol; acidez; oxidativo; osmótico Otras: glucoamilasa +; β-glucosidasa +	[ECY04; ECY35; ECY36; ECY37; ECY38; ECY39]ECY [MYLBB1; MYBB2; MYBB3; MYBB4; MYBrett86; MYBrett87; MYOrval]MY [OYL-201; OYL-202; OYL-203; OYL-216]OY [WY5112; WY5151(PC); WY5526]WY [WLP640; WLP645; WLP648; WLP650; WLP653]WLP [MIP-701; MIP-702; MIP-703; MIP-710; MIP-714; MIP-720; MIP-750; MIP-760]PL [Brettanomyces bruxelensis; Brettanomyces clausenii; Brettanomyces lambicus]LT [W05; W10; W12; W13; W15; W16]IY [Brett B; Brett D; Brett Q; Brett L; Brett M; Brussels Brett; Berliner Brett i; Berliner Brett ii]EL [TYB184; TYB207; TYB261; TYB307; TYB415]YB [BB0022; BB0034A; BB0035C]BB	6, 22, 23, 24, 25, 41, 42, 43, 55, 68, 90, 96
Hanseniaspora uvarum	Ambientes naturales Alimentos y bebidas fermentadas	Cervezas sour Bioflavoring	Atenuación: nr Flavor: banana, solvente POF: nr Tolerancia a estrés: etanol Otras: producción de ácido láctico; β-glucosidasa +	[YH2]WP	6, 30, 67, 77, 88
Lachancea fermentati	Ambientes naturales Alimentos y bebidas fermentadas	Fermentación primaria y coinoculación Cervezas sour NABLAB	Atenuación: < 45% Flavor: cítrico, vinoso POF: negativa Tolerancia a estrés: iso-alfa ácidos Otras: producción de ácido láctico; floculación media	[MYLAY4]MY	9, 11, 77, 79
Lachancea thermotolerans	Ambientes naturales Alimentos y bebidas fermentadas	Fermentación primaria y coinoculación Bioflavoring Cervezas sour	Atenuación: < 65% Flavor: floral, miel POF: nr Tolerancia a estrés: iso-alfa ácidos Otras: producción de ácido láctico y glicerol; β-glucosidasa positiva; floculación negativa; fermentación lenta	[YH39]WP [MYLAY5; MYLAY8]MY [CONCERTOTM]CH [LACHANCEA]LLC [LEVULIA? Alcomeno]AEB [WildBrewTM Philly Sour]L(€)	18, 31, 77, 79, 100
Pichia kluyveri	Ambientes naturales Alimentos fermentados	Coinoculación Bioflavoring NABLAB	Atenuación: nr Flavor: banana, manzana POF: nr Tolerancia a estrés: osmótico; acidez Otras: biotransformación de tioles	[FROOTZEN?]CH [MIP-001]PL	6, 43, 67, 68, 83, 84
Saccharomyces cerevisiae (Kveik)	Granjas (farmhouse) de Noruega	Fermentación primaria Bioflavoring	Atenuación: 65-85% Flavor: tropical, cítrico, floral, miel POF: negativa Tolerancia a estrés: temperatura; secado; iso-alfa ácidos Otras: temperatura fermentación alta: > 28 °C; tasa de inóculo baja: 10% de la recomendada	[ECY43]ECY [Raftevold gård*; Framgarden*; Simonaitis*; Granvin*; Voss*; Midtbust*; Lærdal*; Wollsæter*]MY [OYL-057; OYL-061; OYL-091]OY [WLP518;WLP520]WLP [MIP-340; MIP-342; MIP-343; MIP-350; MIP-352]PL [Seljeset]LT [A43; A44*; A46]IY [Hornindal*; Voss; Årset*; Ebbegarden*]EL [WLP4045]YB [Voss]L [Aurora; Oslo]BB	37, 38, 80, 81
S. cerevisiae var. boulardii	Frutas tropicales (lichi)	Fermentación primaria Cervezas funcionales NABLAB	Atenuación: < 65% Flavor: frutal POF: nr Tolerancia a estrés: temperatura; acidez; etanol Otras: capacidad probiótica	[ECY03B]ECY [Chardonnay]BB	21, 72, 86
S. cerevisiae var. diastaticus	Contaminante de cervecerías	Fermentación primaria Maduración Añejamiento Cervezas bajas en calorías	Atenuación: > 90% Flavor: especiado, frutado POF: positiva Tolerancia a estrés: temperatura; etanol; iso-alfa ácidos Otras: glucoamilasa +	[Infectous Behavior]MY [OYL-019; OYL-025; OYL-026; OYL-027; OYL-039; OYL-042; OYL-056; OYL-200]OY [WY1388; WY3711; WY3724; WY3725-PC; WY3726; WY3739-PC; WY3822-PC; WY3864-PC]WY [WLP026; WLP038; WLP045; WLP073; WLP099; WLP351; WLP545; WLP565; WLP566; WLP570; WLP590; WLP644; WLP885]WLP [MIP-300; MIP-302; MIP-303; MIP-304; MIP-524]PL [A20; A24; B56; B64]IY [Spooky Saison; Wild Thing; Dry Belgian; St. Lucifer Belgian]EL [BE-134; WB-06]F [Belle Saison]L [M29]MJ [WLP4020; WLP4025]YB	49, 50, 54, 64
S. eubayanus	Ambientes naturales	Fermentación primaria y coinoculación Bioflavoring	Atenuación: < 65% Flavor: especiado, ahumado POF: positiva Tolerancia a estrés: osmótico; etanol; iso-alfa ácidos Otras: floculación negativa; baja temperatura de fermentación; psicrófila	EUBY® [Bajo Licencia CONICET-UNComahue desde el IPATEC]	32, 40, 46, 47, 48, 57, 62, 63, 65, 74, 82, 93
Torulaspora delbrueckii	Ambientes naturales Alimentos y bebidas fermentadas	Fermentación primaria y coinoculación Bioflavoring NABLAB	Atenuación: < 65% Flavor: banana, ananá, floral, especiado leve (dependiente de la cepa) POF: positiva (dependiente de la cepa) Tolerancia a estrés: iso-alfa ácidos; etanol; osmótico; baja temperatura Otras: β-glucosidasa +	[YH52]WP [MYTD1; Earth Bender]MY [WLP603]WLP [PRELUDETM]CH [BIODIVATM]L	1, 3, 6, 16, 17, 19, 20, 45, 69, 92
Wickerhamomyces anomalus	Ambientes naturales (roble) Alimentos y bebidas fermentadas	Coinoculación Bioflavoring Cervezas sour	Atenuación: nr Flavor: pera, manzana, durazno POF: positiva Tolerancia a estrés: temperatura; acidez Otras: producción de ácido láctico; sensible a etanol	[MYLAY2]MY	6, 18, 26, 30, 34, 67

Flavor: sabor y aroma; POF: fenoles no deseados (phenolic off flavors); VPR: vinilfenol reductasa; nr: no reportado.

(€) Figura como Lachancea spp.

Empresas comerciales de levaduras no convencionales: ECY: East Coast Yeast (http://www.eastcoastyeast.com/); MY: Mainiacal Yeast (https://www.mainiacalyeast.com/); OY: Omega Yeast (https://www.omegayeast.com); WY: Wyeast Laboratories (https://wyeastlab.com/); WLP: White Labs (https://www.whitelabs.com/); PL: Propagate Lab (https://www.propagatelab.com/); LT: Lev Teck (https://www.levteck.com.br/); IY: Imperial Yeast (https://www.imperialyeast.com/); EL: Escarpments Labs (https://www.escarpmentlabs.com/); YB: The Yeast Bay (https://www.theyeastbay.com/); BB: Bootleg Biology (https://bootlegbiology.com/); WP: Wild Yeast Pitch (http://wildpitchyeast.com/); CH: Chr-hansen (https://www.chr-hansen.com/); LLC: Lachancea LLC (https://lachancea.squarespace.com/); AEB: AEB (https://aebusa.myshopify.com); L: Lallemand (https://www.lallemandbrewing.com/); F: Fermentis (https://fermentis.com); MJ: Mangrove Jacks (https://mangrovejacks.com).

Otras Saccharomyces cerevisiae

Muchas otras bebidas fermentadas tradicionales (como cachaça, chicha, tequila, mezcal y sake) pueden contener una mezcla de levaduras nativas, incluidas S. cerevisiae salvajes o domesticadas para esa bebida específica. Entre dichas cepas, aisladas de diversos sustratos, puede haber una diversidad fenotípica considerable causada por fluctuaciones en los niveles de expresión de genes y la selección debida al estrés ambiental26. Araújo et al. encontraron dos cepas aisladas de cachaça con capacidad de fermentar la maltosa y maltotriosa del mosto cervecero, de crecer a temperaturas bajas, con elevada producción de ésteres de acetato, con baja producción de sulfuros y floculación alta, lo que posibilitaría la producción de cervezas ale y lager de calidad aceptable2. Montandon et al. estudiaron S. cerevisiae salvajes aisladas de ambientes naturales y bebidas fermentadas tradicionales de Brasil en función de los aspectos fisiológicos, la capacidad fermentativa y la producción de compuestos deseables, y pudieron seleccionar levaduras con gran potencial cervecero70. Una cepa fue posteriormente probada a escala semipiloto en las instalaciones de una microcervecería (Grimor Brewery®, Brasil), con lo que se logró desarrollar la primera cerveza con una levadura aislada en Brasil; esta cerveza fue lanzada al mercado bajo el nombre de Grimor 18. Además de conseguirse resultados de elevada reproducibilidad en cuanto a los parámetros de fermentación y compuestos aromáticos producidos, la cerveza también tuvo aprobación por los consumidores70.

Variantes de S. cerevisiae

Existen cepas de S. cerevisiae con características particulares, que por mucho tiempo se las ha considerado variedades dentro de la especie y que tienen cierta relevancia en la producción de bebidas fermentadas o como complemento dietario, tal es el caso de S. cerevisiae variedad diastaticus y S. cerevisiae var. boulardii.

A diferencia de la mayoría de las S. cerevisiae cerveceras (ale), S. cerevisiae var. diastaticus tiene la capacidad de hidrolizar las dextrinas del mosto en azúcares fermentables, lo que causa un alto grado de atenuación (> 90%, cuando para levaduras cerveceras lo normal es entre 65 y 85%97). Esto se debe a que poseen genes STA, los que permiten que la levadura produzca y secrete la enzima glucoamilasa, responsable de la capacidad hidrolítica mencionada (fenotipo STA+)50, 64; esto constituye una ventaja competitiva respecto de las levaduras cerveceras, ya que les permite seguir desarrollándose en la cerveza terminada (ambiente rico en dextrinas)49, 64. Además, su capacidad súper atenuante puede generar una fermentación secundaria, con formación excesiva de dióxido de carbono en botellas, latas o barriles, así como cambios en el sabor, sedimentación y aumento de la turbidez64; en casos extremos, incluso puede producirse la explosión de envases, lo que pone en peligro al consumidor50. Por otra parte, la enzima glucoamilasa ha tomado importancia para el sector cervecero debido a su aplicación en la producción del nuevo estilo Brut IPA, así como para la producción de cervezas bajas en hidratos de carbono. S. cerevisiae var. diastaticus es, además, tolerante a la temperatura y al alcohol, por lo que puede considerarse robusta y capaz de sobrevivir en entornos desfavorables, como el de la cerveza64. La capacidad de producir fenoles (fenotipo POF+), que ocurre como resultado de la descarboxilación del ácido ferúlico y ácido cumárico del mosto, es otra característica que puede considerarse para identificar a esta variedad de levadura. Las levaduras salvajes suelen tener funcionales sus genes PAD1 y FDC1, relacionados con la producción de fenoles volátiles, mientras que las levaduras cerveceras domesticadas tienen mutaciones sin sentido o de cambio de marco de lectura en estos genes, que los vuelven no funcionales (POF−)48. La mayoría de las cepas estudiadas de S. cerevisiae var. diastaticus son productoras de POF, por lo que imparten flavors dominantes especiados y a clavo de olor en la cerveza. Debido a todas las características descriptas, S. cerevisiae var. diastaticus es considerado uno de los microorganismos contaminantes más peligrosos en cervecerías. Sin embargo, es parte de un grupo de levaduras domesticadas muy especializadas que pertenecen a un importante linaje de levaduras cerveceras49. De hecho, son utilizadas en la producción de estilos tradicionales (como Saison, que actualmente está creciendo en popularidad) y muestran potencial para la creación de nuevos productos con características distintivas50. En este contexto, Meier-Dörnberg et al. estudiaron el potencial de aplicación de estas levaduras en la producción de cerveza y encontraron que, además de fermentar dextrinas y producir fenoles, las seis cepas evaluadas presentaban perfiles de sabor y aroma interesantes y diferenciales64. La impresión de flavor principal de las cervezas producidas con S. cerevisiae var. diastaticus fue la de una cerveza similar al vino, de cuerpo seco, con notables sabores fenólicos (similares a clavo de olor) y un sutil flavor frutado; ninguno de los panelistas pudo detectar ningún aroma o sabor desagradable. Los citados autores concluyen que la especie S. cerevisiae var. diastaticus es adecuada para producir cervezas con buenas características organolépticas en condiciones clásicas de fermentación, y que también podrían aplicarse en fermentaciones secundarias o mixtas para producir cervezas con sabores especiales o con bajo contenido de hidratos de carbono64.

Otra variedad dentro de la especie S. cerevisiae cuyo potencial en la industria cervecera ha sido estudiado (y que se desarrollará en una sección posterior) es S. cerevisiae var. boulardii, levadura conocida y estudiada por su capacidad probiótica que, suministrada en cantidades adecuadas, promueve beneficios en la salud del consumidor21, 72.

Saccharomyces eubayanus

Si bien era sabido que la levadura involucrada en la elaboración de cerveza lager era un híbrido entre dos especies de levaduras sacaromicéticas diferentes (híbrido interespecífico), la identidad de los parentales era objeto de debate. El problema se resolvió en 2011 con el descubrimiento de la nueva especie S. eubayanus, que posee una coincidencia genética del 99,6% con la parte parental no-S. cerevisiae del híbrido lager57. Esta especie, en su estado original o puro, se encuentra exclusivamente en los ambientes naturales, en particular, asociada a árboles como los del género Nothofagus (típicos de los bosques de la Patagonia argentina); su presencia fue demostrada en muestras de corteza, hojas, suelo y del hongo endémico Cyttaria spp.57, 82. Unos pocos aislamientos fueron obtenidos de bosques en el este de Asia13, América del Norte78 y Nueva Zelanda39, pero sorprendentemente no en Europa (posible sitio original del evento de hibridización que dio lugar a la levadura lager). El descubrimiento de la madre de las levaduras lager ha despertado interés en el sector científico-tecnológico para el estudio de su potencial aplicación en la industria cervecera.

La criotolerancia es una característica promisoria en levaduras cerveceras para la producción de cervezas lager, ya que la baja temperatura es el factor principal que determina sus propiedades sensoriales, y S. eubayanus es una de las especies con mayor tolerancia al frío dentro del género Saccharomyces, ya que puede crecer rápida y eficientemente a 10 °C40, 46, 65. Respecto de sus capacidades fermentativas, S. eubayanus fermenta la glucosa y maltosa del mosto cervecero, y es capaz de llegar a valores de atenuación promedio del 65%32, 47, 62. Se ha propuesto que la baja atenuación observada para esta especie en comparación con las levaduras cerveceras lager (aproximadamente del 85%) es el resultado de la incapacidad de S. eubayanus para fermentar maltotriosa32, 40, 47, 48, 62, 63, 74. Se realizaron ensayos del consumo con maltotriosa marcada ([14C]- maltotriosa), que demostraron que S. eubayanus es incapaz de transportar este azúcar, y, por lo tanto, de fermentarlo40, 62. En las levaduras lager (y algunas ale), la asimilación de maltotriosa ocurre debido a la presencia de genes que codifican permeasas, como MTT1 y AGT1. Inicialmente se consideró que éstas venían del genoma del parental S. eubayanus. Sin embargo, ninguno de los genomas disponibles de S. eubayanus contiene el gen MTT1, aunque se han observado algunos fragmentos de ADN semejantes al AGT14, 62. Hasta el momento, no se ha logrado que cepas salvajes de S. eubayanus asimilaran la maltotriosa, sino solo a través de estrategias de modificación genética5, 14. Por su parte, esta especie presenta baja floculación, evidenciada por la biomasa en suspensión46, 47. En cuanto a la producción de compuestos de aroma y sabor, S. eubayanus se caracteriza por una producción moderada de ésteres de acetato y de etilo (como el acetato de isoamilo, que aporta aroma a banana y pera), considerados deseables en diversos estilos de cerveza46, 63, 65, 93. Produce, además, concentraciones moderadas a altas de alcoholes superiores, como el alcohol fenetílico (aroma a rosas)93 y otros relacionados con la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada (isobutanol, alcohol isoamílico y 2-metilbutanol), que le pueden dar a la cerveza aromas alcohólicos y similares a solventes, generalmente considerados desagradables cuando están en altas concentraciones46, 65. Se observó, también, la producción de aromas sulfurosos (etanotiol y tioacetato de etilo) durante la fermentación del mosto, al igual que en levaduras lager y algunas ale, pero que, normalmente, se reducen con la maduración (lagering)65. Tal vez el aroma y sabor más característico asociado a las cervezas de S. eubayanus es el flavor a clavo de olor y/o ahumado, derivado principalmente del 4-vinilguaiacol (4-VG)46, 65, 93 y del 4-vinilfenol (4-VF)33. A pesar de su desempeño fermentativo disminuido, S. eubayanus posee muchos atributos ventajosos para la elaboración de cerveza, como el crecimiento celular a baja temperatura (hasta 4 °C), el uso de maltosa y la producción de compuestos aromáticos deseables para algunos estilos de cerveza, por lo que puede ser explotada como herramienta para la diversificación productiva y el agregado de valor41.

El primer producto comercial elaborado exclusivamente con una cepa de S. eubayanus aislada de la Patagonia fue lanzado por Heineken® en 2016 bajo la denominación de Wild Lager H41. En 2018, se firmaron las licencias de comercialización de cervezas realizadas con S. eubayanus por parte de la ACAB (Asociación de Cerveceros Artesanales de Bariloche y la Comarca Andina) bajo el nombre de Proyecto Patagonia Salvaje, donde se realizó la transferencia de la levadura EUBY® (tabla 1) a 11 cervecerías de Bariloche y El Bolsón (Río Negro, Argentina), que lanzaron al mercado sus productos comerciales. La posibilidad de emplear una levadura nativa para la fabricación de cerveza abre las puertas para elaborar cervezas con todos los insumos de origen nacional, dado que las levaduras empleadas en la industria son extranjeras. Cabe aclarar que el hecho de aislar una levadura en territorio de un país no implica necesariamente que dicha levadura es autóctona o nativa de ese ambiente o región, dado que los microorganismos tienen una alta capacidad de dispersión y colonización de sustratos nuevos. Distinto es el caso de la levadura S. eubayanus en la Patagonia argentina y chilena, donde estudios científicos han demostrado que dicha especie es autóctona de los bosques andino-patagónicos32, 53, 74. Más recientemente, y gracias al extenso cultivo de lúpulo y al éxito del cultivo experimental de cebada cervecera llevado adelante por el INTA Bariloche en la zona de El Bolsón y su posterior malteado local, fue posible elaborar la primera cerveza 100% patagónica.

Levaduras no sacaromicéticas

Brettanomyces

Podría decirse que las levaduras no convencionales por excelencia son aquellas pertenecientes al género Brettanomyces (antiguamente denominadas Dekkera), y que son las especies B. bruxellensis y B. anomalus (esta última, también conocida como B. claussenii) las comúnmente relacionadas con la industria cervecera6, 41, 85. Su rol ambiguo en la industria de las fermentaciones es muy conocido. En las cervecerías y, especialmente en las bodegas de vino, Brettanomyces es un reconocido microorganismo contaminante y una causa de grandes pérdidas económicas. Su presencia puede cambiar por completo las propiedades organolépticas del producto debido a la producción de diversos metabolitos secundarios (principalmente fenoles) producidos durante la fermentación alcohólica22. Sin embargo, distintas propiedades potenciales, como su alta producción y tolerancia al etanol, la tolerancia a la presión osmótica, al pH bajo y a bajas concentraciones de oxígeno, la asimilación de nitrato y la producción de otros aromas característicos que aumentan la complejidad del flavor de las bebidas fermentadas, han puesto a esta especie en el centro de atención22.

Históricamente, Brettanomyces ha resultado esencial para la producción de determinados estilos de cerveza (lámbicas, gueuze, otras belgian sours). En la actualidad, las propiedades aromáticas únicas de esta levadura y sus oportunidades para la elaboración de cerveza están siendo reconocidas, y cada vez más cerveceros las agregan deliberadamente a sus fermentaciones, ya sea como cultivo puro o en combinación con cepas cerveceras tradicionales22, 25, 90. Quizás la diferencia de un flavor más destacado con las cepas de levadura Brettanomyces obedece a la producción de fenoles volátiles. Se trata de una conversión en dos pasos donde los ácidos ferúlico y p-cumárico presentes en el mosto son descarboxilados a 4-vinilguaiacol (4-VG) y 4-vinilfenol (4-VP), y luego reducidos a 4-etilguaiacol (4-EG) y 4-etilfenol (4-EP). La descarboxilación está mediada por una descarboxilasa de ácido fenilacrílico (PAD1), mientras que una vinilfenol reductasa (VPR) es responsable de la etapa de reducción42. Este último paso de reducción es representativo de Brettanomyces, por lo que se detectan altas concentraciones de 4-EG y 4-EP en fermentaciones que contienen estas levaduras, pero solo pequeñas cantidades de 4-VG y 4-VP43, 90. El umbral de percepción para estos compuestos es muy bajo, con diversos descriptores de flavor asociados a sudor de caballo, cuero, especiado, medicinal y ahumado, entre otros22. Colomer et al. identificaron por primera vez una cepa de B. anomalus POF−23. Esta cepa (CRL-90) ha perdido el gen PAD1, lo que la convierte en un buen candidato para la obtención de cervezas con las características distintivas de Brettanomyces, pero sin la fuerte impronta dada por los compuestos fenólicos23. Dentro de los compuestos volátiles producidos por Brettanomyces, los ésteres son los más deseados, ya que contribuyen con un agradable flavor frutado a la cerveza. Por lo general, en comparación con la levadura cervecera ale, los ésteres de acetato (como el acetato de isoamilo –banana- y el acetato de fenetilo -miel, floral-) no se producen e incluso son degradados por las esterasas presentes en Brettanomyces. Sin embargo, los ésteres de etilo (como el acetato, lactato, hexanoato, decanoato y octanoato de etilo) están presentes en altas concentraciones, lo que contribuye a los sabores exóticos frutales y tropicales (ananá, mango, pera, uva)25, 68. Además, estas levaduras son capaces de esterificar ácidos grasos de cadena media y larga (comúnmente descriptos como sabores rancios y a «queso») a sus ésteres particulares y, en consecuencia, cambiar el perfil de flavor de la cerveza a sabores dulces a uva, manzana, vino22. Muchos términos diferentes, como clavo, picante, corral, ahumado, plástico, fenólico, medicinal, band-aid®, metálico, cuero húmedo, biscuit, sudor, cabra, manzana, floral, fruta tropical, cítrico o especiado, se utilizan para describir el perfil de aroma de las cervezas producidas con Brettanomyces, pero suelen resumirse más convenientemente como Brett flavor90.

Por otro lado, estas levaduras producen distintas enzimas glucosidasas que tienen impacto en las características sensoriales de las cervezas producidas. Las dextrinas, como la maltotetraosa y la maltopentaosa, están presentes como azúcares residuales después de la fermentación principal de la cerveza. Al igual que S. cerevisiae var. diastaticus, Brettanomyces produce glucoamilasas, enzimas que le permiten hidrolizar estos azúcares complejos en unidades de glucosa y producir cervezas «súper atenuadas», con niveles de etanol ligeramente más altos y concentraciones más bajas de azúcares residuales (y, por lo tanto, contenidos calóricos más bajos)90.

Otra enzima de relevancia producida por Brettanomyces es la β-glucosidasa. La función principal de esta enzima es la hidrólisis de la celobiosa (azúcar presente en la madera) para su posterior uso como fuente de carbono, una característica que puede explicar la capacidad de estas levaduras para sobrevivir durante períodos prolongados en las barricas de madera utilizadas para la fermentación de la cerveza lámbica. Estas enzimas también tienen el efecto de liberar compuestos aromáticos (agliconas), que están unidos por enlaces glucosídicos, lo que agrega complejidad al perfil de flavor de los vinos y cervezas41. En la cerveza, estos glucósidos (compuestos inodoros y no volátiles mientras están unidos a una molécula de azúcar) derivan principalmente del lúpulo y su hidrólisis puede dar lugar a un aumento significativo de compuestos volátiles en la cerveza, incluidos terpenos como el linalol (cítrico, floral y anisado) y el salicilato de metilo (menta y especiado)22, 41.

Las agliconas también pueden originarse a partir de frutas y flores, como en el caso de la cerveza de cereza tradicional Kriek, donde Brettanomyces mejora la producción de compuestos aromáticos como benzaldehído, linalol o eugenol96. Un estudio de β-glucosidasas en 400 cepas de levaduras reveló una fuerte actividad enzimática en las cepas de Brettanomyces, que presentaron valores excepcionalmente altos de esa enzima durante el screening; la enzima β-glucosidasa de B. anomalus fue aislada y caracterizada para su potencial uso como agente natural de bioflavoring96. La actividad de las ß-glucosidasas puede verse inhibida por altas concentraciones de alcohol, y su rango de pH óptimo es 5-698. Por su parte, Colomer et al. observaron la transformación de linalol y geraniol a α-terpineol y β-citronelol, independientemente de la actividad β-glucosidasa de las cepas estudiadas, y relacionaron esta actividad a una contribución directa de proteínas oxidorreductasas24.

La mayoría de los estudios realizados con B. bruxellensis y B. anomalus sugieren el potencial uso de estas levaduras como cultivo puro36, 55. Sin embargo, el tiempo de fermentación resulta muy largo en comparación con las fermentaciones realizadas con levaduras ale; por lo que el uso alternativo de cultivos iniciadores de levaduras cerveceras y de Brettanomyces en inoculaciones secuenciales resulta una buena opción para el desarrollo de nuevas variedades de cerveza43, 55, 68.

Solo se necesitan unas pocas células de Brettanomyces para que su carácter aparezca, y una cantidad excesiva puede resultar sensorialmente perjudicial para cervezas realizadas con estas levaduras. Una tasa de inoculación de 2 × 105 cél./mL resulta efectiva (mucho más baja que la utilizada para ale o lager, que es 0,75-1,5 × 106 cél./mL)98. Al realizar cervezas en barrica de madera nuevas, la recomendación es inocular el doble de esa tasa, de modo que la levadura pueda establecerse98. Lo único que impide que muchos cerveceros experimenten con Brettanomyces es la preocupación por la contaminación cruzada. Si no se procede cuidadosamente, en poco tiempo puede encontrarse «Brett flavor» en todas las cervezas de la fábrica. Brettanomyces se dispersa fácilmente y puede formar biofilms. Sin embargo, procedimientos adecuados de limpieza y sanitización minimizan estos riesgos98.

Lachancea

El género Lachancea, al igual que Saccharomyces, pertenece a la familia Saccharomycetaceae52 (fig. 1). Las especies de dicho género han sido aisladas de una amplia variedad de ambientes naturales, como muestras de árboles, suelo, fuentes de agua e insectos, así como de ambientes antrópicos como alimentos y bebidas fermentadas79. Algunas de ellas eran conocidas antiguamente con el género Klyuveromyces52. Las especies Lachancea thermotolerans y Lachancea fermentati son las que se han aislado con mayor frecuencia y las que poseen la más amplia diversidad de nichos ecológicos; se las ha encontrado principalmente asociadas a mosto de uva y ambientes de bodega79. Si bien las características de flavor y la producción de ácido láctico en L. thermotolerans han sido bien estudiadas en vino71 (principalmente en coinoculaciones con S. cerevisiae12), el estudio de la aplicación de levaduras de este género en la industria cervecera es escaso y reciente9, 18, 31, 77. En un estudio en el que se evaluaron las características fermentativas de tres cepas de L. thermotolerans en mosto cervecero, se demostró su capacidad de consumo de maltosa (similar al control S. cerevisiae anchor ale), aunque en tiempos largos de fermentación (2-3 semanas); asimismo, ninguna fue capaz de consumir la maltotriosa presente en el mosto. En particular, se destacó la elevada producción de ácido láctico (2-6 veces mayor que la cepa ale), así como una producción de glicerol un 40% mayor (compuesto que aporta a la sensación de cuerpo)31; Zdaniewicz et al. también encontraron una elevada producción de glicerol por L. thermotolerans100. Se demostró, además, una tasa de inoculación óptima de 2 × 106 cél./mL/°P, tolerancia a los iso-alfa-ácidos provenientes del lúpulo, un fenotipo no floculante y una actividad β-glucosidasa mayor que la levadura ale31.

Sensorialmente, L. thermotolerans produce cervezas con mayores contenidos de acetato y butirato de etilo (floral, miel, dulce) comparado con S. cerevisiae (cepa comercial US-05)18. Por su parte, L. fermentati (KBI 12.1) también posee capacidad de fermentar maltosa (aunque un 20% menor que la cepa ale), no asimila la maltotriosa, es tolerante a los iso-alfa-ácidos, es POF− y posee una floculación moderada9. Con esta cepa fueron producidas cervezas de baja graduación alcohólica (2,2% v/v etanol) y un pH final de 3,6 (debido a la producción de ácido láctico). El contenido de alcoholes superiores resultó menor que con la levadura ale (cepa comercial WLP001), y la producción de ésteres, tres veces mayor. Las cervezas obtenidas fueron descriptas sensorialmente como frutadas, con carácter vinoso, cítrico y ácidas9.

L. thermotolerans y L. fermentati son levaduras heterofermentativas que, como se describe, pueden producir etanol y ácido láctico como subproductos de la fermentación77; este último compuesto es un actor principal en la producción de estilos de cerveza sour. Esto sitúa a las especies de Lachancea en la mira para el desarrollo de cervezas diferenciales. Las cervezas sour son producidas, generalmente, haciendo uso de bacterias lácticas a partir de dos metodologías para lograr la acidificación del mosto. Una es inoculando los microorganismos antes de la fermentación (con técnicas como sour mash o kettle sour); la otra es inoculando durante la fermentación o después de esta utilizando cultivos mixtos, o bien inoculaciones secuenciales77. A partir del estudio y la potencial aplicación de Lachancea sp. surge una nueva propuesta, el primary souring77, consistente en la producción de cervezas inoculadas únicamente con levaduras heterofermentativas, como es el caso de L. thermotolerans y L. fermentati. Por su parte, se encontró una cepa (MN477031) de L. thermotolerans que se destacó entre muchas otras debido a la baja producción de ácido láctico y a su influencia marginal en la disminución del pH en comparación con S. cerevisiae (cepa comercial T-58); esta cepa presenta un elevado potencial para la producción de diferentes tipos de cerveza, sin limitarse solo a sours100.

Es posible adquirir cepas comerciales de L. thermotolerans, en tanto que el mercado para cepas de L. fermentati es más limitado (tabla 1). Sin embargo, es probable que el constante crecimiento del sector y el auge de cervezas sour hagan que exista una mayor disponibilidad de diferentes especies y cepas del género Lachancea en los próximos años. En Argentina, se han aislado en los últimos años cepas de Lachancea de diversos sustratos32, 33, 66 (incluso otras especies nuevas), cuyo potencial en la producción de cervezas está comenzando a ser estudiado en nuestro laboratorio.

Torulaspora delbrueckii

El género Torulaspora también pertenece a la familia Saccharomycetaceae52 (fig. 1) y, a pesar de que por décadas fue considerada un contaminante común en cervezas, la especie Torulaspora delbrueckii ha sido foco de atención por su capacidad de impartir características interesantes a las bebidas fermentadas. Esta levadura se encuentra presente en diversos ambientes (frutas, malta y suelos)52 y ha sido domesticada por el ser humano a lo largo de 4.000 años1. T. delbrueckii fue la primera levadura no sacaromicética en ser comercializada para la producción de vinos (en 2003), ésta es conocida en la industria vitivinícola por incrementar el flavor frutado1, 3. King y Dickinson fueron los primeros en observar el potencial de esta especie en la producción de cerveza, al detectar su capacidad para modificar el aroma del producto final a partir de la biotransformación de monoterpenos del lúpulo (lo que genera mayores cantidades de linalol)45. Posteriormente, se encontró que cervezas fermentadas con esta especie (pura y en fermentaciones mixtas con S. cerevisiae) presentaron una mejora en sus características aromáticas respecto de cervezas control ale (cepa comercial US-05) debido a la presencia de altos niveles de compuestos aromáticos, como hexanoato de etilo, α-terpineol y feniletanol (aroma frutal, rosas, chicle y banana), resultados que fueron confirmados por páneles de cata19, 69. Asimismo, T. delbrueckii ha mostrado un impacto sensorial positivo vinculado a una baja producción de compuestos indeseables como ácido acético y acetaldehído16, 92, junto con una baja producción de fenoles volátiles69.

Las temperaturas para la fermentación varían entre los 20 y 28 °C y, debido a que algunas cepas no fermentan maltosa y maltotriosa, los niveles de alcohol resultan bajos, en el orden del 0,8 a 4% v/v69; por lo que estas cepas resultarían promisorias para la elaboración de cervezas con bajo contenido de alcohol16. Una ventaja adicional de T. delbrueckii es su capacidad de resistir diversas condiciones de estrés, como altas concentraciones de alcohol (9-11% v/v) y alto contenido de iso-alfa-ácidos del lúpulo (antimicrobiano)69, lo que le permite fermentar mostos intensamente lupulados y alcohólicos, como es el caso de cervezas India Pale Ale (IPA). Por otro lado, esta levadura posee alta tolerancia osmótica, por lo que puede fermentar mostos de densidad media y alta, con elevada producción de ésteres y alcoholes superiores20. Si bien el uso de T. delbrueckii en cultivos puros y mixtos aporta un flavor aromático muy agradable y particular, los resultados fermentativos y organolépticos asociados a esta especie dependen, principalmente, de la cepa utilizada17, 69.

Prelude® (Chr. Hansen®, Copenhague, Dinamarca) y Biodivia® (Lallemand Inc.®, Brooklyn Park, Australia) son dos ejemplos de diferentes cepas de T. delbrueckii que se comercializan actualmente. La cepa Biodivia® es capaz de generar menor porcentaje de etanol y niveles inferiores de ésteres y alcoholes superiores (excepto alcohol isoamílico) respecto de la cepa Prelude®92. Sin embargo, en cervezas fermentadas con Biodivia® se notaron niveles de butanoato de etilo (frutado, frutilla) significativamente mayores que los generados por la cepa Prelude®, por lo que posee un gran potencial para incrementar el flavor de cervezas con bajo contenido alcohólico. Por otro lado, con la cepa Prelude®, es posible obtener cervezas con niveles de decanoato de etilo (floral, ananá) y dodecanoato de etilo (floral, coñac) notablemente más altos (15 y 50 veces mayores, respectivamente)92. En cuanto a la producción de terpenos, se han observado mayores concentraciones de β-cariofileno, α-farnesceno y cadaleno en cervezas elaboradas con Prelude®, lo que demuestra la mayor capacidad por parte de esta cepa para biotransformar terpenos a través de la actividad β-glucosidasa92.

Al igual que en el caso del género Lachancea, existen aislamientos naturales de Torulaspora de la Patagonia argentina32, 33, que se suman a la larga lista de cepas para estudiar como potenciales herramientas de diversificación productiva en la industria cervecera.

Innovación productiva y tecnológica no convencional

En respuesta al aumento de la demanda de los consumidores, la industria cervecera ha dedicado muchos esfuerzos de investigación al desarrollo de nuevas tecnologías e innovaciones para la expansión de variedades de cervezas alternativas. El uso de levaduras no convencionales es de particular interés para producir cervezas alternativas con flavors novedosos, cervezas bajas en calorías, cervezas sin alcohol o bajas en alcohol y cervezas funcionales20, 85.

Bioflavoring con levaduras no convencionales

Diversas técnicas son aplicadas para ajustar los aromas y sabores de alimentos y bebidas a las nuevas demandas del mercado. Aunque los productos químicos sintéticos aún se utilizan ampliamente, los flavors obtenidos a través de métodos biológicos (bioflavors) son cada vez más solicitados por los consumidores, preocupados por los problemas ambientales y de salud causados por los químicos sintéticos y aditivos. Los bioflavors pueden extraerse de plantas o ser producidos haciendo uso de cultivos de células vegetales, microorganismos o enzimas aisladas. El bioflavoring microbiológico, con especial énfasis en el uso de levaduras no convencionales, es el foco para el desarrollo de cervezas innovadoras. Este objetivo se puede lograr de diversos modos: (a) inoculando una sola especie de levadura como cultivo puro, b) usando diferentes microorganismos en fermentaciones secuenciales o coinoculadas, c) haciendo uso de organismos genéticamente modificados (OGM) y d) por adición de enzimas secretadas por microorganismos6, 20, 94.

Distintas especies en cultivo puro a menudo producen altas concentraciones de compuestos que les permiten aportar aromas y sabores específicos al producto. Kluyveromyces marxianus, por ejemplo, produce niveles relativamente altos de compuestos con aroma a rosas, como feniletanol y acetato de fenetilo41, y las ya discutidas especies de Brettanomyces, Lachancea y S. eubayanus producen altas concentraciones de compuestos de bioflavoring distintivos, como fenoles y ésteres frutales. Además de Lachancea, especies de levaduras como Schizosaccharomyces japonicus, Wickerhamomyces anomalus, Hanseniaspora vineae y Hanseniaspora uvarum han sido utilizadas como inóculo puro para la producción de cervezas sour30, 77. Hanseniaspora uvarum se encuentra asociada a la fase inicial de las fermentaciones espontáneas de cervezas lámbicas88, aporta flavors frutales y es productora de la enzima β-glucosidasa6; se puede acceder a cultivos comerciales de esta especie (tabla 1).

Muchas levaduras no convencionales no pueden utilizar todos los azúcares fermentables del mosto, por lo que diversos estudios han sugerido el uso de estas levaduras como agentes de bioflavoring en fermentaciones coinoculadas con cepas de levaduras cerveceras. Aquí, la capacidad fermentativa de las levaduras salvajes resulta secundaria y el enfoque se basa más bien en una mayor producción de compuestos aromáticos deseables y, a menudo únicos, donde la producción de alcohol se logra, por ejemplo, con cepas ale o lager26, 41. Como se vio antes, T. delbrueckii y especies de Brettanomyces se han propuesto como agentes de bioflavoring cuando las levaduras están involucradas en la cofermentación con cepas cerveceras.

Pichia kluyveri es capaz de fermentar solo la glucosa del mosto, con una baja producción de etanol, por lo que resulta un candidato interesante para la fermentación secuencial en busca de una mejora de los sabores frutados en la cerveza. Esta levadura genera una elevada cantidad de acetato de isoamilo (80 mg/l después de dos días de fermentación) y también produce otros compuestos frutales, como propionato y butirato de etilo (ananá), valerato de etilo (manzana), decanoato de etilo (frutado, manzana) y octanoato de etilo (ananá, tropical, manzana, coñac)43, 68, 83. Además, se ha reportado la capacidad de esta especie de convertir precursores presentes en las uvas en tioles polifuncionales, que proporcionan aroma a frutas tropicales al vino. Estos precursores están también presentes en el lúpulo, por lo que P. kluyveri podría incrementar el flavor de la cerveza mediante esta transformación43. Por su parte, diversos autores han aplicado W. anomalus con éxito en co-cultivos con levaduras cerveceras para mejorar el perfil de aroma de la cerveza. Se demostró que estas levaduras son buenas productoras de ésteres, principalmente de acetato de etilo y otros, como acetato de isoamilo y butirato de etilo, por lo contribuyen a mejorar la complejidad aromática del mosto fermentado con notas frutales, como manzana, pera y durazno6, 18, 34.

Otro aspecto interesante relacionado con el bioflavoring tiene que ver con la biotransformación de compuestos presentes en el mosto por acción de las levaduras. Las levaduras no solo son responsables de la producción directa de compuestos aromáticos, sino que también pueden mediar la bioconversión de precursores de flavor covalentemente unidos, no volátiles e inodoros, en compuestos de flavor activos. De esta manera, la elección de una cepa adecuada puede liberar esta fracción potencial de aroma y sabor. Diversos compuestos flavor activos, como los alcoholes monoterpenos, los norisoprenoides y los alcoholes alifáticos, pueden unirse covalentemente a un azúcar (en general, β-D-glucosa) para formar glucósidos no volátiles e inodoros. Estos glucósidos están presentes en ingredientes importantes de los medios de fermentación, como el lúpulo en la cerveza89. Como ya fue discutido previamente, la separación de estos compuestos del residuo de azúcar puede afectar positivamente el aroma de la cerveza y, algunas levaduras, como Brettanomyces, pueden producir las enzimas β-glucosidasas, que catalizan esta reacción de liberación. Muchas otras especies son conocidas por secretar estas enzimas, incluidas algunas levaduras sacaromicéticas y diversas no sacaromicéticas, como Debaryomyces spp., Hanseniaspora spp., Scheffersomyces shehatae y Pichia terrícola41, 68. Todas las cepas mencionadas son candidatos interesantes para ser usados en fermentaciones mixtas de bebidas cuyo flavor se desea realzar o diversificar. Existen registros de levaduras de los tres géneros mencionados obtenidas de ambientes naturales de la Patagonia argentina15, 32.

Cervezas bajas en calorías (light)

Debido a las campañas de marketing dirigidas al cuidado del peso y a minimizar los riesgos que conlleva la obesidad, el interés sin precedentes en las calorías y las dietas han estimulado a la industria cervecera a desarrollar cervezas bajas en calorías99. Las cervezas bajas en calorías se pueden elaborar abordando algunos métodos de producción alternativos, particularmente, buscando reducir la concentración de hidratos de carbono en el producto final. Un método factible es la «dilución» de hidratos de carbono del mosto, que desafortunadamente conduce a cervezas poco expresivas y poco estructuradas, a menudo calificadas como acuosas y menos preferidas por los consumidores6, 99. Son más aceptados, entonces, los métodos alternativos: las cervezas light se pueden producir mediante una maceración especial, que da lugar a grandes cantidades de azúcares fermentables, o mediante el proceso fermentativo de un mosto regular en condiciones específicas, como la inoculación de microorganismos que pueden hidrolizar los azúcares más complejos para reducir las concentraciones de azúcares residuales en el producto final. Éste es el caso de Brettanomyces y S. cerevisiae var. diastaticus, que producen glucoamilasas y glucosidasas. Estas enzimas permiten la hidrólisis de hidratos de carbono no fermentables para formar azúcares simples, estos son posteriormente fermentados durante la etapa de fermentación primaria, conduciendo a cervezas más bajas en calorías6, 20, 99. En este aspecto, dado que el etanol tiene un mayor valor energético en comparación con los hidratos de carbono, la producción de cervezas bajas en calorías implica que parte del alcohol sea posteriormente eliminado99. A partir de un estudio de la incidencia de levaduras contaminantes en múltiples cervezas embotelladas y de muestras de proceso de elaboración de cerveza en fábricas de la Patagonia argentina, fue posible aislar más de 20 levaduras de S. cerevisiae var. diastaticus54 que resultarían interesantes para la producción de cervezas bajas en calorías.

Cervezas sin alcohol o bajas en alcohol

Por su parte, la creciente preocupación de los consumidores por la salud y el abuso del alcohol han motivado a la industria cervecera a producir cervezas sin alcohol y con bajo contenido de alcohol8, 99. La terminología de cerveza «sin alcohol» y «baja en alcohol», así como las reglamentaciones legales relativas a los límites de alcohol, muestran muchas diferencias en cada país. En Argentina, la cerveza sin alcohol es aquella cuyo contenido alcohólico es inferior o igual a 0,5% v/v; para cervezas bajas en alcohol no existe una regulación vigente, pero suelen entenderse como las cervezas con un contenido de etanol entre 0,6-3,5% v/v8. Las estrategias para producir cervezas sin alcohol o bajas en alcohol (NABLAB) se pueden dividir en procesos físicos y biológicos. Los métodos físicos (evaporación, filtración por membrana) se basan en la eliminación del alcohol de la cerveza terminada y requieren inversiones considerables de equipamiento especial. Los enfoques biológicos más utilizados se basan en la formación limitada de etanol durante la fermentación de la cerveza, donde las levaduras se inactivan o eliminan antes de que comiencen a producir etanol en grandes cantidades. Por lo general, se realiza por pasteurización, por centrifugación o enfriando rápidamente la cerveza en fermentación a 0 °C, y suelen utilizarse los equipos de cervecería tradicionales, por lo que no requieren inversiones adicionales, pero el producto suele caracterizarse por presentar off flavors. En ambos casos la cerveza pierde cuerpo y frescura y, lo más importante, los compuestos de flavor disminuyen o se eliminan debido a su evaporación con el alcohol en el primer caso, o la ausencia de su formación en el último8, 99. El uso de levaduras no convencionales con capacidades limitadas para utilizar los azúcares del mosto (maltosa y maltotriosa, en particular) constituye una alternativa útil para producir cervezas sin alcohol y con bajo contenido de alcohol, pero que aún conservan, o, en algunos casos mejoran, parte de la complejidad aromática. Dichas levaduras son capaces de producir elevadas cantidades de ésteres que enmascaran los sabores indeseables, e incluso, algunas reducen los aldehídos del mosto eliminando así el sabor a mosto que, a menudo, se encuentra en las cervezas bajas en alcohol producidas por el método de fermentación detenida20.

Diferentes especies no convencionales tienen estas características y están siendo evaluadas y utilizadas para la producción de NABLAB. Un buen ejemplo de esto es el uso de Saccharomycodes ludwigii28, 44, 58. Las cervezas producidas con esta levadura tienen una concentración muy baja de alcohol (< 0,1% v/v) debido a su incapacidad de fermentar maltosa y maltotriosa, y muestran buenos perfiles de flavor debido a su producción de ésteres y alcoholes superiores28, 44, 58. Sin embargo, la producción de ésteres y el contenido de etanol de la cerveza final depende de la cepa28; están disponibles comercialmente las cepas WSL-17 (Hefebank Weihenstephan®) y WLP618 (White Labs®), con aplicación en la industria cervecera. Por otra parte, se demostró que cultivos puros de cepas de T. delbrueckii son capaces de producir cervezas con un contenido de etanol que varía del 0,9 a 2,6% v/v, caracterizadas por interesantes sabores frutales16, 68, 69. Asimismo, Bellut et al. aislaron de kombucha cepas de T. delbrueckii, junto con cepas de Hanseniaspora valbyensis, Hanseniaspora vineae, Zygosaccharomyces bailii y Zygosaccharomyces kombuchaensis, con potencial para la producción de cervezas sin alcohol, que se comportaron fermentativa y sensorialmente de manera similar que la cepa ale comercial (WLP001)7. Cepas de L. fermentati aisladas también de kombucha fueron evaluadas para establecer su potencial de producción de cervezas bajas en alcohol. Pudo obtenerse por el método de fermentación detenida una cerveza con contenido de alcohol menor del 1,3% v/v y una proporción equilibrada entre el dulzor de azúcares residuales y la acidez láctica producida. Sin embargo, se detectaron niveles altos de diacetilo (debido a la fermentación detenida), de modo que se debe mejorar el proceso para reducir su concentración a niveles aceptables11. Se ha encontrado también que se puede producir una bebida baja en alcohol o sin alcohol, con un perfil de flavor muy cercano a una cerveza estándar, usando cepas de P. kluyveri. Como se vio, esta levadura solo usa la glucosa del mosto y tiene la capacidad de convertir este sustrato en una alta concentración de compuestos de flavor específicos, los principales son el acetato de isoamilo, el alcohol isoamílico, el butirato de etilo, el hexanoato de etilo y el octanoato de etilo83, 84. Por otro lado, en un estudio dirigido a la detección de levaduras basidiomicetes de Mrakia spp. para la producción de cervezas bajas en alcohol, se descubrió que una cepa psicrófila de M. gelida produjo una cerveza más aromática (con descriptores de damasco, uva y lichi) en comparación con la producida por un cultivo comercial de S. ludwigii29. Una cepa de Cyberlindnera mrakii demostró tener aplicación en la fermentación de cervezas bajas en alcohol extrafrutales, debido a la capacidad de aumentar los niveles de ésteres de acetato y retener los terpenos y terpenoides del mosto lupulado59. Scheffersomyces shehatae56, Zygosaccharomyces rouxii87 y Cyberlindnera subsufficiens10 son otras especies consideradas para el desarrollo de cervezas NABLAB.

Cervezas funcionales

Las cervezas funcionales se obtienen mediante el enriquecimiento con sustancias promotoras de la salud y se considera que estas cervezas brindan beneficios para la salud si se consumen en cantidades moderadas. Estas cervezas alternativas se producen mediante el uso de levaduras no convencionales, capaces de producir o transformar algunos compuestos beneficiosos, como la melatonina, una hormona implicada en la regulación del sueño en los mamíferos y que posee propiedades antioxidantes. Algunas levaduras pueden producir esta sustancia durante la fermentación6. Entre las cervezas funcionales, una novedad está dada por las cervezas probióticas, obtenidas mediante la incorporación de agentes probióticos21. Estos son microorganismos utilizados como suplementos alimenticios que, en una dosis correcta, son potencialmente beneficiosos para la salud humana, sobre todo, para el equilibrio microbiano intestinal72. La cerveza artesanal sin filtrar y sin pasteurizar puede ser considerada como una nueva herramienta para aportar efectos beneficiosos debido a que las levaduras permanecen viables en la bebida, lo que es crucial para la eficacia de los probióticos21. La mayoría de los microorganismos probióticos son bacterias; S. cerevisiae var. boulardii es la única levadura utilizada ampliamente como probiótico y, a menudo, comercializada como suplemento dietético. Posee propiedades que la convierten en un agente probiótico potencial, como la supervivencia a temperatura corporal (37 °C), la resistencia a los ácidos estomacales y biliares, y la supervivencia al ambiente competitivo del tracto intestinal21. Se demostró que esta levadura es capaz de fermentar los azúcares presentes en el mosto cervecero a temperaturas de hasta 2 °C, y de crecer en presencia de iso-alfa-ácidos (hasta 60 mg/l) y etanol (hasta 16% v/v)86, lo que hace posible su aplicación en la producción de cerveza. Se ha evaluado S. cerevisiae var. boulardii como único cultivo iniciador, así como en co-cultivos, y se obtuvieron cervezas con mayor actividad antioxidante, menor contenido de alcohol (NABLAB) y características sensoriales similares a las obtenidas con levaduras cerveceras, por lo que dicha levadura resulta ser una herramienta muy prometedora para aumentar la calidad saludable del producto21, 72, 85, 86. Por otro lado, se demostró que una cepa de B. bruxellensis que expresa una alta actividad de β-glucosidasa es capaz de producir resveratrol, una molécula con acciones antioxidantes y antienvejecimiento. Investigaciones futuras podrían considerar tal capacidad para la producción de cervezas funcionales22, 30, 51.

Conclusiones y perspectivas

Las levaduras no convencionales poseen un considerable potencial para su explotación en la industria cervecera y representan una forma natural de introducir diversidad en el producto. Muchas especies de levaduras están emergiendo como candidatos para la producción de cervezas alternativas y diferenciales. La innovación no solo se basa en la obtención de productos con una mayor complejidad de aromas y sabores, sino además, en enfocar en nuevos nichos comerciales que demandan cervezas distintas, en un mercado en crecimiento (por ej. cervezas NABLAB, bajas en calorías, funcionales).

Actualmente, los cerveceros se encuentran reinterpretando el rol de las levaduras en general (subestimadas en cuanto a su capacidad de influir en el flavor de las cervezas) y de las no convencionales, en particular (estigmatizadas históricamente como contaminantes en la industria de las bebidas), por lo que existe un retraso en aprovechar la elevada funcionalidad que éstas ofrecen. Las cervecerías modernas mantienen altos niveles de sanitización y control, por lo que resulta comprensible que sean reacias a introducir levaduras nuevas, potencialmente contaminantes. El manejo en fábrica de estas levaduras alternativas es, asimismo, diferente en cuanto a cuestiones técnicas, como tasa de inoculación, temperaturas de fermentación, estrategias de reutilización, oxigenación y nutrición en general, por lo que requiere de un aprendizaje y de pruebas previas, a fin de lograr las características deseadas en el producto. Es por ello que todos los estudios tendientes a lograr una mejor comprensión del desempeño fermentativo y organoléptico de estas levaduras, así como de la propagación y la estabilidad de los inóculos, resultan de gran importancia para que gradualmente los productores puedan introducirlas en sus fábricas.

Si bien muchas de las levaduras discutidas en este trabajo han sufrido algún tipo de proceso de domesticación, está claro que aquellas que no han estado nunca en contacto con la industria de las fermentaciones pueden ser bioinsumos útiles para la producción de cervezas diferenciales, y, en particular, con identidad regional. La mayoría de las especies y géneros aquí mencionados como de interés cervecero cuenta con versiones salvajes, que pueden encontrarse en los ambientes naturales. La región andina de la Patagonia argentina se ha revelado como un reservorio muy interesante de levaduras de alto valor científico-tecnológico, al contar con levaduras sacaromicéticas (S. eubayanus y S. uvarum) y no sacaromicéticas de géneros como Lachancea, Hanseniospora, Torulaspora, Cyberlindera, Mrakia, Zygosaccharomyces o Pichia, entre otras. Por otro lado, se han obtenido recientemente numerosos aislamientos de S. cerevisiae var. diastaticus sumamente interesantes a partir de cervezas contaminadas, también de la Patagonia argentina. Todas estas levaduras son potenciales herramientas de innovación productiva, y su estudio y adecuada conservación son fundamentales a fin de poder transferir bioinsumos útiles para el agregado de valor y diferenciación productiva a un sector económico pujante y de fuerte impacto regional. A su vez, el potencial de estas levaduras alternativas excede al mundo cervecero y son de importancia para la producción de otros tipos de bebida y de alimentos, como el vino76, la sidra35, el whisky y los panificados, entre otros (Álvarez y Libkind, enviado para su publicación).

Otro enfoque que se está implementando y que involucra a algunas de estas levaduras no convencionales es el de aplicar estrategias de mejora de levaduras no domesticadas, ya sea por una acelerada adaptación al mosto cervecero a través del método de evolución experimental dirigida (EED), o por la hibridación selectiva entre cepas o especies con características deseables complementarias. Estas son técnicas no generadoras de organismos genéticamente modificados (OGM) que pueden emplearse para mejorar las características de estas levaduras no convencionales o simplificar su uso industrial. El caso más destacado, sin duda, es el de la generación de nuevas variantes de levaduras lager a través de la hibridización de cepas salvajes de S. eubayanus y levaduras domesticadas de S. cerevisiae33, 46, 47, 48, 65. Hasta el momento, no se dispone comercialmente de levaduras desarrolladas por estos métodos. Existen otros métodos de mejora que implican la manipulación genética, como serían la ingeniería genética y biología sintética, que están siendo empleados o investigados, pero que involucran la generación de OGM, los cuales tanto la industria como los consumidores aún no aceptan. Revisiones de los distintos tipos de abordajes de mejoramiento genético ya han sido publicadas 41, 97 o están en vías de publicación (Eizaguirre et al., en preparación). Queda en evidencia que en el sector cervecero, tanto industrial como artesanal, ha comenzado una nueva etapa en la que las levaduras van a tener un mayor protagonismo como consecuencia de los cambios en las demandas del mercado, de recientes descubrimientos científicos y de la búsqueda de levaduras distintas de las tradicionales ale y lager. Si bien ya existen levaduras no convencionales con distinta posibilidad de acceso para los productores cerveceros, es de esperar que gradualmente la diversidad y accesibilidad de estas cepas vaya en aumento.

Financiación

Este trabajo fue financiado por el proyecto PICT 3677 del FONCyT, el proyecto PIP424 del CONICET y la Universidad Nacional del Comahue (Proyecto B199) otorgados a DL. JB es beneficiaria de una beca CONICET.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Nuestro agradecimiento a los apasionados productores de cerveza artesanal de la Argentina, en particular de la Patagonia, quienes inspiraron esta serie de artículos de revisión. A Martín Moliné por su ayuda en el armado y diseño de la figura.

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