Diego Libkind , Chris Todd Hittinger , Elizabeth Valerio , Carla Gonçalves , Jim Dover , Mark Johnston , Paula Gonçalves , y José Paulo Sampaio
PNAS 30 de agosto de 2011 108 (35) 14539-14544; https://doi.org/10.1073/pnas.1105430108
Editado por John Doebley, Universidad de Wisconsin, Madison, WI, y aprobado el 20 de julio de 2011 (recibido para revisión el 5 de abril de 2011)Resumen
La domesticación de plantas y animales promovió la transición de la humanidad de los estilos de vida nómadas a los sedentarios, la expansión demográfica y el surgimiento de civilizaciones. En contraste con los éxitos bien documentados de los cultivos y la ganadería, los procesos de domesticación de los microbios siguen siendo oscuros, a pesar de la importancia de los microbios para la producción de alimentos, bebidas y biocombustibles. Lager-beer, elaborada por primera vez en el siglo XV, emplea una levadura híbrida alotetraploide, Saccharomyces pastorianus (sin. Saccharomyces carlsbergensis ), una especie doméstica creada por la fusión de una levadura de Saccharomyces cerevisiae con una especie de Saccharomyces criotolerante desconocida . Informamos el aislamiento de esa especie y la designamos.Saccharomyces eubayanus sp. nov. debido a su parecido con Saccharomyces bayanus (un híbrido complejo de S. eubayanus , Saccharomyces uvarum y S. cerevisiae que se encuentra solo en el entorno de elaboración de la cerveza). Los individuos de las poblaciones de S. eubayanus y su especie hermana, S. uvarum , existen en simpatría aparente en los bosques de Nothofagus (haya del sur) en la Patagonia, pero están aislados genéticamente a través de barreras postzigóticas intrínsecas y ecológicamente a través de la preferencia del huésped. El borrador de la secuencia del genoma de S. eubayanus es idéntico en un 99,5% a la porción no S. cerevisiae del S. pastorianusLa secuencia del genoma sugiere cambios específicos en el metabolismo del azúcar y el sulfito que fueron cruciales para la domesticación en el entorno de elaboración de cerveza. Este estudio muestra que la combinación de la ecología microbiana con la genómica comparativa facilita el descubrimiento y la preservación de las reservas genéticas silvestres de microbios domesticados para rastrear su historia, identificar cambios genéticos y sugerir caminos para un mejoramiento industrial.
El inicio de la agricultura y la domesticación de plantas y animales se encuentran entre los eventos más decisivos de la historia de la humanidad, ya que desencadenaron el auge de las civilizaciones y los desarrollos demográficos, tecnológicos y culturales asociados ( 1 ). La domesticación de la cebada en la Media Luna Fértil ( 2 ) llevó a la aparición del antepasado de la cerveza moderna en Sumeria hace 6.000 años ( 3 ). La cerveza y otras bebidas alcohólicas pueden haber desempeñado un papel fundamental en la consolidación de las sociedades humanas a través del acto social y los rituales de la bebida ( 4 ) y al proporcionar una fuente de nutrición, medicina y agua no contaminada ( 5).). Dado que la aparición de bebidas fermentadas se corresponde aproximadamente con la domesticación de plantas y animales, es probable que algunos linajes de levadura con rasgos favorecidos también se domesticaran involuntariamente.
En Europa, la elaboración de la cerveza evolucionó gradualmente durante la Edad Media para producir cerveza tipo cerveza, un proceso llevado a cabo por Saccharomyces cerevisiae , la misma especie involucrada en la producción de vino y pan de levadura. La elaboración de cerveza lager se produjo en el siglo XV en Baviera, obtuvo una amplia aceptación a fines del siglo XIX ( 6 ) y desde entonces se ha convertido en la técnica más popular para producir bebidas alcohólicas, con más de 250 mil millones de dólares en ventas globales en 2008 ( 7 ). A diferencia de la mayoría de las cervezas y vinos, las cervezas requieren fermentaciones lentas a baja temperatura que se llevan a cabo por las cepas de Saccharomyces pastorianus (sin. Saccharomyces carlsbergensis ) ( 8 ); otros dos saccharomyces criotolerantesspp. se han asociado con la cerveza como contaminantes ( Saccharomyces bayanus ) y con sidra o vino fermentado a bajas temperaturas ( Saccharomyces uvarum ) ( 9 ). S. pastorianus nunca ha sido aislado de la naturaleza, depende de los humanos para su propagación y parece ser una especie híbrida alotetraploide de S. cerevisiae y una especie no identificada ( 10 , 11 ). Se han avanzado varias hipótesis para la fuente del genoma no S. cerevisiae presente en S. pastorianus , incluida la especie taxonómica y genéticamente compleja S. bayanus ( 12).- 14 ) y un linaje "lager" desconocido, distinto de S. bayanus y S. uvarum ( 11 , 15 ). La identificación de la reserva genética silvestre del subgenoma criotolerante de S. pastorianus es necesaria para resolver la taxonomía y la sistemática de este importante complejo de especies, y para comprender los eventos clave que llevaron a la domesticación de la levadura lager.
En contraste con la extensa investigación sobre la domesticación de cultivos y ganado ( 2, 16- 19 ), los estudios de domesticación de microbios eucariotas han sido limitados ( 20- 24 ), quizás debido a la incapacidad de realizar estudios de campo directos. La identificación de la base genética de los rasgos que se seleccionan durante la domesticación puede aclarar la aparición de nuevos rasgos y mostrar el camino hacia una mejora adicional. Debido a que los linajes domesticados se derivan de un subconjunto de las poblaciones originales, es probable que un cuello de botella genético haya causado la desaparición de algunos alelos ( 17 ), especialmente en los microbios, que a menudo se propagan de forma clónica. En una época de destrucción acelerada del hábitat y disminución de la biodiversidad, el descubrimiento de reservas genéticas silvestres de microbios domesticados facilitará la preservación de sus recursos genéticos para el mejoramiento de la cepa.
Resultados y discusión
Descubrimiento de poblaciones salvajes de Saccharomyces criotolerantes .
Saccharomyces spp. están asociadas con robles (Fagaceae) en el hemisferio norte ( 25 , 26 ). Debido a que las especies del género Nothofagus (hayas del sur, también miembros de los Fagales) ocupan el nicho de roble en las regiones templadas del hemisferio sur ( 27 ), nuestra encuesta en la Patagonia del noroeste para Saccharomyces se centró en los bosques que contienen poblaciones de Nothofagus antarctica , Nothofagus dombeyi , y Nothofagus pumilio , dentro y cerca de los Parques Nacionales Lanin y Nahuel Huapi (Argentina) ( Fig. S1 ). También estudiamos los estomas de Cyttaria hariotii.(un parásito ascomiceto obligado de Nothofagus spp.) porque estas estructuras fructíferas son ricas en azúcares simples y proporcionan un hábitat de levadura favorable ( 28 ). Un total de 133 muestras de corteza de Nothofagus , suelo de debajo de los árboles, y Cyttariastromata, recolectadas de 2006 a 2008, produjeron 123 aislamientos de Saccharomycescriotolerantes y dos aislamientos de S. cerevisiae ( Tabla S1 ).
Para una identificación preliminar de los aislamientos de Saccharomyces criotolerantes , determinamos la secuencia de ADN de los genes individuales, realizamos la huella dactilar por PCR y examinamos los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), utilizando S. bayanus CBS 380 T , S. uvarum CBS 395 T , y S. uvarumCBS 7001 (referido como S. bayanus en la literatura genómica) como referencias ( Fig. S2 ). Los aislamientos se dividen discretamente en dos grupos: el grupo A aparece relacionado con S. bayanus (78 aislamientos); El grupo B está estrechamente relacionado con S. uvarum (45 aislamientos). La ocupación casi completa del Nothofagus.El nicho de especies criotolerantes contrasta con nuestro estudio en curso de la biogeografía de Saccharomyces en el nicho de roble del hemisferio norte (América del Norte, Mediterráneo, Europa Central y Japón), donde hemos aislado ∼240 cepas de Saccharomyces de más de 500 muestras de roble y hemos observado que las especies simpátricas Tienden a tener diferentes preferencias de temperatura de crecimiento. Por ejemplo, S. cerevisiae (termotolerante) y Saccharomyces kudriavzevii (criotolerante) coexisten en regiones mediterráneas, pero Saccharomyces paradoxus (termotolerante) y S. uvarum (criotolerante) coexisten en Europa templada y América del Norte ( 26). Por lo tanto, la detección de un par de especies criotolerantes en la Patagonia y la casi ausencia de especies termotolerantes sugieren que el ecosistema patagónico que apoya a Saccharomyces spp. puede ser inusual Una posible explicación es que las temperaturas medias anuales relativamente bajas en nuestros sitios de aislamiento patagónicos [6/8 ° C con temperaturas medias bajas de −1 / −2 ° C y temperaturas medias altas de 22/23 ° C ( 29 )] pueden favorecer criotolerantes sobre las especies termotolerantes.
Aislamiento ecológico y genético de dos especies criotolerantes.
La detección no anticipada de dos poblaciones criotolerantes simpátricas estrechamente relacionadas nos llevó a investigar el grado de aislamiento genético entre ellas mediante la medición de la esterilidad meiótica de los híbridos de las dos poblaciones. La viabilidad de las esporas dentro de las poblaciones fue del 89% al 91%, pero los híbridos produjeron solo un 7,3% de esporas viables. Por lo tanto, las dos poblaciones exhiben un considerable aislamiento poszigótico intrínseco y pueden considerarse dos especies biológicas diferentes, aunque son fenotípicamente indistinguibles ( Fig. S3 ). Además, la población A se encontró en asociación con N. antarctica y N. pumilio , mientras que la población B se asoció con N. dombeyi ( P <10 −7; Prueba exacta de Fisher) ( Tabla 1 ). El Evergreen N. dombeyi prevalece en los sitios mésicos del mediodía, pero N. antarctica y N. pumilio son deciduos y tienden a reemplazar a N. dombeyi en los sitios de alta elevación y xéricos ( 27 ), lo que sugiere que la división local de nichos al menos explica parcialmente La aparente coexistencia de estas dos especies. Se requieren estudios de campo y de laboratorio detallados sobre las causas de aislamiento.
Tabla 1.
Aislamiento De Saccharomyces Criotolerantes En Patagonia
| Aísla | |||
| No. de muestras | Población A | Población B | |
| N. antarctica | 47 (9C, 23B, 15S) | 29 (7C, 17B, 5S) | 4 (2C, 2B) |
| Nº enano | 32 (2C, 15B, 15S) | 25 (1C, 10B, 14S) | 5 (1C, 3B, 1S) |
| N. dombeyi | 54 (12C, 27B, 15S) | 8 (5C, 2B, 1S) | 38 (8C, 21B, 9S) |
| Total | 133 (23C, 65B, 45S) | 62 | 47 |
- Las muestras utilizadas en los aislamientos corresponden a Cyttaria hariotii (C), corteza de Nothofagus (B) y suelo recolectado debajo de los árboles (S). Los números se refieren al número de muestras o al número de aislamientos. Las asociaciones estadísticamente significativas están en negrita ( P <10 −7 ).
Secuencias genómicas resuelven la taxonomía y sistemática de Saccharomyces .
La identificación y taxonomía de S. bayanus, S. pastorianus y S. uvarum es problemática y controvertida porque S. bayanus y S. pastorianus solo se han aislado de las fermentaciones asociadas a los humanos. De hecho, todos los representantes conocidos de estas dos especies han sido sospechosos ( S. bayanus ) ( 13 ) o confirmados ( S. pastorianus ) ( 10 ) como híbridos interespecies. Una posible excepción es el NBRC 1948, el contaminante de la elaboración de la cerveza, que se afirmó que era una cepa pura de S. bayanus basada principalmente en la evidencia RFLP de los 16 cromosomas ( 15). Un amplio estudio de varias cepas asignadas previamente a S. bayanus , S. pastorianus y S. uvarum llevó a la conclusión de que existe un linaje o especie "lager" adicional que contribuyó con su genoma a S. pastorianus ( 15 ). En contraste, la secuencia del genoma de S. uvarum CBS 7001 carece de signos de hibridación, introgresión o eventos horizontales de transferencia génica de otras Saccharomyces spp. ( 30 ).
Para resolver estos problemas taxonómicos y sistemáticos e identificar de manera concluyente nuestras cepas patagónicas, generamos un borrador de secuencias genómicas de un representante de cada especie patagónica y varios aislamientos clave de elaboración mediante el ensamblaje de millones de secuencias de 36 pb, utilizando la secuencia del genoma de S. uvarum como referencia. . La comparación de estas secuencias del genoma nos permitió probar de manera concluyente: ( i ) si nuestras poblaciones salvajes y patagónicas A y B están compuestas de linajes puros; ( ii ) si NBRC 1948 es una línea pura o un híbrido; ( iii ) la composición de las cepas tipo de S. uvarum (CBS 395 T ) y S. bayanus (CBS 380 T ); y ( iv) la identidad del resto no- S. cerevisiae del genoma de S. pastorianus .
S. eubayanus sp. nov. Es el stock genético salvaje perdido de S. pastorianus .
La comparación del borrador de las secuencias del genoma reveló que las dos especies patagónicas difieren entre el 6% y el 8% de los nucleótidos en los genomas de las cepas estudiadas [ Fig. 1 (explicada en detalle en la leyenda), y los conjuntos de datos S1 y S2] (divergencia promedio). 6.89%). La uniformidad de la divergencia de secuencia sugiere que ha habido poca o ninguna introgresión reciente entre las especies patagónicas, consistente con la baja viabilidad de esporas del cruce híbrido. (No se puede excluir la introgresión de regiones que son pequeñas, subteloméricas, difíciles de ensamblar o que faltan en algunas cepas). La cepa de la especie B está estrechamente relacionada con la cepa de referencia de S. uvarum (divergencia promedio del 0,52%) y con su tipo cepa CBS 395 T, pero la cepa de la especie A está estrechamente relacionada con el resto que no es S. cerevisiae del genoma de la levadura lager de S. pastorianus (divergencia promedio 0,44%). En contraste con estas cepas esencialmente puras, el componente principal del genoma del tipo de cepa de S. bayanus (CBS 380 T ) es S. uvarum (67%), aunque hay contribuciones sustanciales de la especie A (33%), incluyendo Varias regiones heterocigotas grandes (19% del genoma). De manera similar, grandes porciones del genoma de NBRC 1948 se derivan de S. uvarum (37%), pero la mayoría de estas porciones se derivan de la especie A (63%).
Figura 1.
S. eubayanus sp. nov. es distinto de S. uvarum y donó su genoma a S. pastorianus . Los 16 cromosomas de S. uvarum se muestran como ejes x , con marcas de control cada 100 kbp; la divergencia (no corregida) en relación con S. uvarum CBS 7001 ( 30 ) se representa sobre cada cromosoma; la divergencia relativa a S. eubayanus se grafica (invertida) debajo de cada cromosoma. Las cepas están codificadas por colores según la clave. Cada cepa aparece arriba y debajo de los cromosomas para representar ambas comparaciones. S. uvarum CBS 395 T solo se muestra en el conjunto de datos S1 ; la patagónica S. eubayanusLa cepa de referencia solo se muestra sobre los cromosomas. Para evitar el solapamiento de las comparaciones, algunas cepas se compensan con el eje x de la siguiente manera: S. eubayanus , 0.3%; NBRC 1948, 0,2%; CBS 380 T , 0,1%. CBS 380 T contiene alelos S. uvarum y S. eubayanus en varias regiones, por lo que su porcentaje de heterocigosidad (de pares de bases) también se muestra en gris delgado sobre los cromosomas. Las gráficas de divergencia para una cepa generalmente se mueven en paralelo por encima y por debajo de los cromosomas porque casi todas las regiones de cada cepa están estrechamente relacionadas con el S. uvarumo el S. eubayanusReferencia (dentro del 2% del eje en un lado y 6-8% en el otro lado). Las diferencias cuantitativas reflejan regiones con diferentes tasas de evolución, regiones heterocigotas (CBS 380 T ) o regiones que pueden albergar alelos más antiguos debido a la clasificación incompleta del linaje. Por ejemplo, en el brazo izquierdo del cromosoma VI, CBS 380 T es heterocigoto, pero NBRC 1948 contiene solo alelos de S. uvarum ; moviéndose a la derecha, CBS 380 T se vuelve homocigoto a S. uvarum , y NBRC 1948 contiene una gran sección de S. eubayanus antes de regresar a las características de S. uvarum hacia el telómero. A través del borrador de secuencias de genoma filtradas (aproximadamente 80% de las ventanas de 1 kb), S. pastorianusestá compuesto por alelos de S. eubayanus (> 99.9%), y el S. uvarum patagónico está estrechamente relacionado con la referencia de S. uvarum (> 99.9%).
También se examinaron las lecturas de la secuencia corta en busca de evidencia de introgresión, hibridación o transferencia horizontal de genes utilizando dos métodos diferentes y la Saccharomyces spp disponible . Genomas de referencia (ver Materiales y Métodos SI ). No encontramos evidencia de genes extraños ni en la cepa patagónica ni en la cepa tipo S. uvarum . Aunque estos análisis no pueden excluir las contribuciones extranjeras entre los genes que faltan en Saccharomyces spp. conjunto ortólogo, son lo suficientemente sensibles como para detectar fácilmente las contribuciones subteloméricas de S. cerevisiae en las dos cepas de S. bayanus (CBS 380 T y NBRC 1948) ( Conjunto de datos S3 ).
Dadas las claras diferencias en el fondo ecológico y en la constitución genómica entre la especie híbrida S. bayanus y la especie A esencialmente pura, proponemos considerar el linaje patagónico salvaje como una especie distinta: S. eubayanus sp. nov. Además, estos análisis de la secuencia del genoma establecen firmemente a S. eubayanus como el donante del subgenoma no S. cerevisiae de S. pastorianus , y excluyen la contribución de una especie "lager" desconocida sustancialmente divergente de S. cerevisiae y S. eubayanus ( Conjunto de datos S4 ). En cambio, un amplio estudio de las cepas ( Fig. S2) y las secuencias genómicas de nuestras dos cepas representativas de S. bayanus ( Fig. 1 y Conjuntos de datos S1 y S3 ) sugieren que la diversidad de esta especie híbrida puede explicarse por la contribución de mezclas de alelos de S. uvarum y S. eubayanus , junto con algunos genes aportados por S. cerevisiae .
Evidencia de Domesticación.
La domesticación de cultivos y ganado selecciona las características deseables a través de la reproducción direccional para que los linajes domesticados se vuelvan genéticamente distintos de sus ancestros silvestres en formas que los hacen más útiles para los humanos ( 16 , 17 ). Para determinar qué cambios genéticos podrían haberse favorecido en la elaboración de cerveza, se buscaron diferencias entre el genoma de S. eubayanus y tres cepas domesticadas asociadas con la elaboración de cerveza ( S. pastorianus y los híbridos triples CBS 380 T y NBRC 1948).
La maltosa disacárida es uno de los azúcares más abundantes en el mosto, por lo que su utilización es un rasgo muy seleccionado en el entorno de elaboración de la cerveza ( 11, 31 ). Al igual que S. pastorianus , las cepas híbridas triples asociadas con la elaboración de cerveza contienen grupos de genes de maltosa subtelomérica ( MAL ) transferidos horizontalmente desde S. cerevisiae , así como el gen SUC4 de S. cerevisiae para procesar la sacarosa disacárida ( Conjunto de datos S3 ). Sorprendentemente, descubrimos que estas tres cepas comparten un punto de ruptura de translocación cromosómica idéntico dentro de ZUO1 ( YGR285C ) que fusiona el brazo derecho de S. eubayanusEl cromosoma VII a las secuencias subteloméricas en el brazo derecho del cromosoma VII de S. cerevisiae ( Fig. 2 A y B ). El fragmento transferido transporta el gen IMA1 de S. cerevisiae ( YGR287C ) que codifica la isomaltasa, que cataliza la disociación del isactosa disacárido ( 32 ). Los puntos de ruptura idénticos indican un origen común para este gen de procesamiento de azúcar de S. cerevisiae en las tres cepas híbridas y sugieren una fuerte selección para la utilización óptima del azúcar durante la elaboración de la cerveza.
Figura 2.
S. pastorianus y dos cepas híbridas triples asociadas con la elaboración de cerveza comparten alelos de domesticación idénticos. ( A ) Análisis de la ventana deslizante de la sinergia del sitio ( dS , Jukes-Cantor corregida) para las regiones de codificación subteloméricas con flechas que marcan la dirección de la transcripción y con el esquema de color y el eje y como en la Fig. 1 , excepto que el dS se muestra a S. cerevisiae ( Scer ), en lugar de S. uvarum ( Suva ); Las compensaciones de valores de y necesarias para la visualización son 10 veces más grandes que en la Fig. 1por la diferente escala; Se trazan 2,000 sitios con una ventana de 100 sitios, un paso de uno, y un espaciador intergénico arbitrario de 200 sitios. ( B ) Primer plano de secuencias de codificación parciales con puntos que denotan identidad. Observe el punto de ruptura que fusiona la porción 3 'de S. eubayanus ( Seub ) ZUO1 (azul) a la porción 5' de ScerZUO1 (marrón) y los genes distales, incluidos ScerBIO2 y ScerIMA1 . [ S. pastorianus claramente posee ScerIMA1 y el punto deinterrupción de ZUO1 , pero hay una brecha a través de ScerBIO2 en la asamblea publicada ( 11 )]. ( C) La secuencia de codificación parcial y la traducción de SUL1 resaltan una eliminación de 1 pb en SpasSUL1 que causa una mutación de cambio de marco inactivante. S. pastorianus ( Spas ) también representa NBRC 1948 y CBS 380 T en B y C porque todos los pares de bases llamados son idénticos en las secuencias de codificación de ERV29 , ZUO1 , BIO2 y SUL1 en esas cepas.
La formación de sulfito también es importante en la elaboración de cerveza lager porque el sulfito es un antioxidante y estabilizador del sabor ( 31 ). Se observó previamente que S. pastorianus Weihenstephan 34/70 tenía copias inactivas de los genes SUL1 de S.cerevisiae y S. eubayanus , mientras que conservaba versiones funcionales de ambos genes SUL2 ( 11 ), que codifican los transportadores de sulfato de alta afinidad, la metabólica precursor del sulfito ( 33 ). Sorprendentemente, encontramos que ambas cepas híbridas triples contienen la misma mutación de cambio de marco que S. pastorianus en sus copias de S. eubayanus SUL1 ( Fig. 2 C). Curiosamente, la expresión selectiva de SUL2 , especialmente el alelo de S. eubayanus , ha demostrado mejorar la producción de sulfito ( 34 ). Debido a que encontramos que el gen SUL1 está intacto en S. eubayanus , es probable que la inactivación de SUL1 sea una consecuencia de la selección artificial en el entorno de elaboración de la cerveza. Las pérdidas de SUL1 y algunos transportadores de MAL sugieren una tendencia a descartar selectivamente sistemas de transporte de nutrientes menos eficientes y retener o adquirir otros que son más eficientes en condiciones de elaboración de cerveza, una compensación que posiblemente resulte de las limitaciones de espacio 2D de la membrana de plasma.
Evolución de S. pastorianus y S. bayanus bajo domesticación.
Sobre la base de nuestros análisis genómicos y comparativos, S. bayanus abarca un conjunto de cepas híbridas conocidas solo en el entorno de elaboración industrial, mientras que S. eubayanus existe como un linaje esencialmente puro en condiciones naturales en la Patagonia. De acuerdo con nuestro modelo ( Fig. 3 ), en el ambiente de lager-cervecería del siglo XV ( 6 ), los genomas silvestres de S. eubayanus comenzaron a fusionarse con los genomas de S. cerevisiae tipo ale para dar lugar a híbridos alotetraploides, eventos raros que parecen Han pasado al menos dos veces ( 10 ). En estos ancestros del S. pastorianus moderno , los cruces mitóticos y otros mecanismos de reparación del ADN fusionaron algunos.Los cromosomas de S. cerevisiae a loscromosomas de S. eubayanus hacen que algunas partes del genoma sean homocigotas y otras regiones aneuploides ( 10 , 11 ). Las porciones de S. eubayanus de estas fusiones cromosómicas que ocurrieron en S. pastorianus habrían proporcionado una secuencia casi idéntica para sembrar la recombinación necesaria para introducir el ADN de S. cerevisiae en otras cepas de S. eubayanus y S. uvarum que llegan al entorno de elaboración de cerveza, por lo tanto Poco a poco dando lugar al complejo S. bayanus.genoma Alternativamente, los tremendos tamaños de población logrados en el ambiente de elaboración pueden haber permitido la recuperación de esporas híbridas viables extremadamente raras o que las cepas regresen a la euploidía a través de un ciclo parasexual. Debido a que todos los genes de S. cerevisiae detectados en los híbridos triples son subteloméricos en los genomas de referencia de S. uvarum o S. cerevisiae , creemos que la transformación es el mecanismo más probable porque requiere solo un cruce proximal al gen subtelomérico bajo selección, y explica la ausencia de transferencia generalizada de genes proximales de S. cerevisiae que se esperaría bajo los otros modelos. Independientemente del mecanismo de transferencia de genes, las mutaciones idénticas de cambio de marco ( SUL1), los puntos de interrupción del cromosoma ( IMA1 ) y las secuencias de autoestopas idénticas sugieren que los cerveceros impusieron una fuerte selección positiva al elegir las mejores cepas o al propio entorno de elaboración de cerveza competitivo para propagar estos alelos a S. pastorianus y ambos híbridos triples de S. bayanus .
Fig. 3.
Un modelo de la formación de S. pastorianus y las cepas híbridas de S. bayanus . En primer lugar, S. eubayanus silvestre y S. cerevisiae de tipo ale se hibridaron para formar un alotetraploide que dio lugar a S. pastorianus . En segundo lugar, la domesticación impuso una fuerte presión selectiva para las cepas con las propiedades de elaboración más deseables. Tercero, en las cubas de elaboración con altas densidades de S. pastorianus , la lisis celular libera grandes fragmentos de ADN que ocasionalmente se transforman, en cuarto lugar, contaminando las cepas silvestres de S. eubayanus debido a la falta de técnicas de cultivo puro. En quinto lugar, los múltiples eventos de hibridación con cepas salvajes de S. uvarum dieron lugar a CBS 380T y NBRC 1948. Este modelo no excluye la participación previa o paralela de S. uvarum en la elaboración de cerveza o la contaminación.
Es sorprendente que nunca se hayan encontrado aislados europeos de S. eubayanus , a pesar de los registros de aislamiento de levaduras desde finales del siglo XIX, incluido un énfasis reciente en el muestreo de entornos arbóreos más naturales ( 26 ). La fácil recuperación de esta especie de la Patagonia sugiere que S. eubayanus pudo haber estado ausente en Europa hasta que se importó de ultramar después de la llegada del comercio transatlántico. En marcado contraste, su especie hermana, S. uvarum , se ha aislado repetidamente en Europa tanto de sustratos artificiales (p. Ej., De elaboración de la cerveza) como naturales (p. Ej., Insectos, corteza). Aunque se requiere un muestreo ambiental adicional en todo el mundo, parece probable que cualquier nicho europeo natural adecuado para S. eubayanus están ocupadas por otras especies, pero que encontró un gran éxito a través de la hibridación en el nuevo entorno artificial de las cervecerías lager.
La divergencia de la secuencia del 7% del genoma entre S. eubayanus y S. uvarum es el nivel más bajo observado dentro del género Saccharomyces para dar lugar a un aislamiento genético y ecológico ( Tabla S2 ). La distribución geográfica y la aparente diferenciación de nicho de estas especies hermanas las convierten en un sistema genéticamente tratable para estudiar la especiación de hongos en la alopatía con contacto secundario o en simpatía debido a factores ecológicos.
Taxonomía de S. eubayanus , S. bayanus y S. uvarum .
La nomenclatura de S. bayanus y S. uvarum ha sido confusa y controvertida durante décadas. Los altos valores de reasociación de ADN-ADN entre las cepas tipo de estas dos especies ( 35 ) llevaron a Naumov a defender su fusión, con S. uvarum inicialmente considerado como un sinónimo de S. bayanus ( 36 ), y más tarde una variedad ( 12 ). Otros estudios que emplean métodos moleculares documentaron dos grupos bien separados ( 37 , 38 ), lo que llevó a propuestas para el restablecimiento de S. uvarumcomo una especie separada ( 13 , 14).). Desafortunadamente, la ausencia de una resolución clara de estos problemas taxonómicos causó que CBS 7001, una cepa seleccionada para la secuenciación del genoma ( 30 ), se denominara S. bayanus (en lugar de S. uvarum ) en la mayoría de la literatura genómica subsiguiente y bases de datos Sin embargo, todas las cepas conocidas de S. bayanus (incluido el tipo de cepa CBS 380 T ) parecen ser híbridos de S. eubayanus y S. uvarum que contienen contribuciones de S. cerevisiae en al menos algunos casos ( Fig. S2 ). Por lo tanto, como S. pastorianus , S. bayanus.no es una "especie" en el sentido ecológico y evolutivo y se ve mejor como un producto del entorno de elaboración artificial sin presencia en la naturaleza. Debido a que ahora es evidente que las designaciones varietales y de otro tipo adoptadas por algunos investigadores carecen de apoyo científico, proponemos que " S. uvarum " y " S. eubayanus" se usen como descriptores de especies biológicamente significativas, mientras que " S. bayanus" y " S. pastorianus ” debe restringirse a los linajes domesticados e híbridos.
Descripción estándar.
Descripción Estándar de Saccharomyces Eubayanus Sampaio Libkind, Hittinger, P. Goncalves, Valerio, c Goncalves, Dover Johnston et sp. noviembre
Etymol .: El epíteto se elige para referirse al linaje puro y natural que está relacionado con la especie híbrida Saccharomyces bayanus Saccardo.
Células globosas a ovoides (2.5–5 × 5–7 μm). Pseudomycelium ausente. Asci ovalada y persistente que contiene de dos a cuatro ascosporas redondas. La principal característica diagnóstica es la secuencia del genoma depositada en la base de datos del NCBI. Las propiedades fisiológicas más importantes se enumeran en el conjunto de datos S5 . La cepa CBS 12357 T (CRUB 1568 T , PYCC 6148 T ) se designa como la cepa tipo.
Descripción latina.
Descripción latino de Saccharomyces Eubayanus Sampaio Libkind, Hittinger, P. Goncalves, Valerio, c Goncalves, Dover Johnston et sp. noviembre
Especies de saccharomycete. Las células esférica a ovoide. Pseudomicelio no. óvalos ASCI, persistentes, 2-4 ascosporis espejos esféricos. Las siguientes secuencias de todo el genoma en una colección de ácido nucleico en los depósitos SRA030851 número NCBI SRP006155. Cultura, CBS 12357 t .
Procesos de domesticación en los reinos taxonómicos.
La domesticación es un proceso inherentemente evolutivo, cuya comprensión requiere la inferencia de estados ancestrales, ya sea por comparación con poblaciones progenitoras silvestres o por investigaciones arqueológicas. Las características de las especies no descritas previamente S. eubayanus explican la formación instantánea de S. pastorianusmediante hibridación con S. cerevisiae . La selección impuesta por el entorno de la elaboración de la levadura lager más refinada, y hemos identificado varios cambios genéticos relacionados con la producción de cerveza. Dadas las diversas naturalezas mecanicistas de los cambios genéticos que ocurrieron durante la domesticación de cultivos y ganado ( 2 , 17 , 18), anticipamos que en el futuro se descubrirán cambios genéticos adicionales que no son obvios a partir de las comparaciones de secuencias, como los cambios en la regulación de los genes y los mecanismos para integrar dos genomas separados por millones de años de evolución. La identificación de estos cambios evolutivos y el acceso al stock salvaje previamente desconocido prometen iluminar el papel que las bebidas fermentadas han jugado en la civilización humana y proporcionar nuevas estrategias para mejorar las levaduras para la elaboración de cerveza y la producción de biocombustibles.
Materiales y métodos
Aislamiento de levadura, caracterización preliminar y cruces.
El protocolo selectivo utilizado para los aislamientos de Saccharomyces se describió anteriormente ( 26 ). La identificación preliminar se basó en la confirmación de la producción de ascoesporas de Saccharomyces ; Secuenciación de ADN de FSY1 , FUN14 , HIS3 , MET2 , RIP1 ( Conjunto de datos S6 ) y la región ITS de ADNr ; Impresión de huellas dactilares por PCR con cebadores (GTG) 5 y M13 ( 39 ); y PCR-RFLP utilizando FUN14 digerido con BanII, RIP1 digerido con PstI y HIS3 digerido con RsaI ( 15) ( Fig. S2 ). Se cruzaron ascosporas aisladas de las cepas S. eubayanus CRUB 1568 y S. uvarum CRUB 1595 para obtener híbridos interespecies. La hibridación se confirmó con PCR-RFLP como anteriormente. La viabilidad interespecífica de las esporas se determinó al examinar 362 ascosporas producidas por tres cepas híbridas independientes. Para la evaluación de la viabilidad intraespecífica de las esporas, se estudiaron aproximadamente 100 ascosporas de cada una de las dos especies (cepas CRUB 1568, CRUB 1595).
Secuenciación y análisis del genoma.
El borrador de las secuencias del genoma de derivados monosporicos de CRUB 1568 (FM1318), CRUB 1595 (FM1317) y NBRC 1948 (FM1309) se determinaron mediante el ensamblaje de secuencias de Illumina de 36 pb de un solo paso en la secuencia del genoma de referencia de S. uvarum CBS 7001 ( 30 ), como se describió anteriormente ( 40 ) con modificaciones ( SI Materials and Methods ). Las esporas viables de CBS 380 Ty CBS 395 T no se recuperaron, por lo que los genomas de estas cepas se secuenciaron sin más manipulación y se mostró que eran aneuploides, lo que proporciona una explicación probable para su esterilidad. Los análisis de la secuencia del genoma se realizaron utilizando scripts PERL personalizados y software estándar.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a la Administración de Parques Nacionales de Argentina por la recogida de permisos. Agradecemos al Centro de Recursos Biológicos NITE de Japón por proporcionar la cepa NBRC 1948, a R. Ulloa por su ayuda durante el trabajo de campo preliminar, a M. Weiss por preparar el diagnóstico latino ya RA Sclafani por la lectura crítica del manuscrito; y S. Fontenla y MR van Broock por su asistencia y asesoramiento. Este trabajo fue apoyado por Fundação para a Ciência ea Tecnologia Grants PTDC / BIA-BDE / 71734/2006 (a PG y JPS), SFRH / BPD / 46471/2008 (a EV), UNComahue Grant CRUB B143 (a DL), Nacional Institutes of Health Grant GM032540 (a MJ), y la Fundación James S. McDonnell (CTH y MJ). CTH es el miembro de Maclyn McCarty de la Fundación Helen Hay Whitney.
Notas al pie
- ↵ 3 A quién debe dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: jss@fct.unl.pt .
- Contribuciones de los autores: investigación diseñada por DL, CTH, MJ, PG y JPS; DL, CTH, EV, CG y JD realizaron investigación; DL y CTH contribuyeron con nuevos reactivos / herramientas analíticas; Datos analizados de DL, CTH, PG y JPS; y CTH, PG y JPS escribieron el documento.
- Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
- Este artículo es un envío directo PNAS.
- Depósito de datos: los datos del genoma se han depositado en el Archivo de Secuencia de Lectura de la Información del Centro Nacional para Biotecnología ( www.ncbi.nlm.nih.gov/sra ) (números de secuencia SRP006155 de SRA030851); Los genes individuales se han depositado en GenBank (números de acceso JF786614 - JF786710 ).
- Este artículo contiene información de respaldo en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1105430108/-/DCSupplemental .
Referencias
