Efecto Crabtree

Autor: Sebastián Oddone

 

Gracias a la respiración, nosotros los humanos, obtenemos la energía necesaria para poder llevar adelante todas nuestras actividades. Lo mismo ocurre con la levadura, quien mantiene la capacidad de respirar oxígeno y de esa forma sostener sus reacciones metabólicas.

Sin embargo, a diferencia de lo que nos pasa a nosotros, que en ausencia de oxígeno (condiciones anaeróbicas) no somos capaces de “respirar”, la levadura sí puede. La manera en que lo logra es mediante la fermentación alcohólica. Es decir, la fermentación sería una manera alternativa de obtener energía sin la necesidad de respirar oxígeno. La eficiencia en cuanto a la obtención de energía mediante la fermentación es significativamente menor que la de la respiración aeróbica, pero antes que nada…

Una primera conclusión es qué, si a la levadura la privamos de oxígeno, ella se las rebusca y utiliza su metabolismo anaeróbico para seguir viviendo.

Pero esto no es todo, existe un fenómeno muy particular con la levadura de cerveza que consiste en lo siguiente:

Si se encuentra en un contexto de alta concentración de azúcares simples (glucosa), a pesar de contar con oxígeno disponible, fermenta y produce alcohol etílico. Situación que se da justamente al inicio de la fermentación de cerveza, ¿Por qué haría esto la levadura, si en cambio por respirar oxígeno obtendría energía mucho más eficientemente?

Bien, este fenómeno tan llamativo se denomina “Efecto Crabtree”, y se piensa que lo realiza para defenderse de los contaminantes. Es decir, a pesar de tener oxígeno, en condiciones de exceso de azúcar (le sobra azúcar), invierte parte de ella en generar alcohol a modo de defensa.

 

Fuentes consultadas: Chris White, Yeast, 2010 / Thomas Pfeiffer, An Evolutionary Perspective on the Crabtree Effect, Front. Mol. Biosci., 2014

https://www.facebook.com/sebastian.oddone.9/posts/3891642560917535

Una perspectiva evolutiva del efecto Crabtree

 Thomas Pfeiffer * y Annabel Morley
Instituto de Estudios Avanzados de Nueva Zelanda, Universidad Massey, Auckland, Nueva Zelanda

La capacidad de fermentar azúcares en etanol es un rasgo metabólico clave de las levaduras. Las levaduras Crabtree-positivas utilizan la fermentación incluso en presencia de oxígeno, donde podrían, en principio, depender de la vía respiratoria. Esto es sorprendente porque la fermentación tiene un rendimiento de ATP mucho menor que la respiración (2 ATP frente a aproximadamente 18 ATP por glucosa). Si bien se han identificado eventos genéticos en la evolución del efecto Crabtree, las ventajas selectivas proporcionadas por este rasgo siguen siendo controvertidas. En esta revisión, analizamos las explicaciones de la aparición del efecto Crabtree desde una perspectiva evolutiva y teórica del juego. Sostenemos que una mayor tasa de producción de ATP es probablemente el factor más importante detrás de la aparición del efecto Crabtree.

Introducción

El trifosfato de adenosina (ATP) es un compuesto clave en el metabolismo energético celular, donde impulsa procesos dependientes de la energía libre como el movimiento, el transporte, la biosíntesis y el crecimiento. Las levaduras generalmente pueden usar dos vías diferentes para producir ATP a partir de azúcares, a saber, la respiración y la fermentación (Figura 1). Mientras que la respiración da como resultado un alto rendimiento de ATP (en Saccharomyces cerevisiae aproximadamente 18 ATP por glucosa), la fermentación tiene un rendimiento de ATP mucho menor (2 ATP por glucosa) pero no requiere oxígeno. A altos niveles de azúcar y oxígeno, las levaduras pueden producir ATP a través de la respiración, la fermentación o el uso concurrente de ambas vías. Dos estrategias se observan comúnmente y se relacionan con el conocido efecto Crabtree (De Deken, 1966 ; Postma y Verduyn, 1989; Van Urk et al., 1990): el uso exclusivo de respiración en levaduras Crabtree negativas y el uso simultáneo de fermentación y respiración en levaduras Crabtree positivas. Las levaduras Crabtree-positivas probablemente surgieron casi al mismo tiempo que las plantas con flores, cuyas frutas y néctar ricos en azúcar podrían haber proporcionado un nuevo nicho a las especies de levadura ancestrales (Piškur et al., 2006). Varios eventos genéticos, como la duplicación del genoma completo, el recableado regulador del metabolismo energético de la levadura y las duplicaciones del transportador de hexosa, probablemente han contribuido al efecto Crabtree (Wolfe y Shields, 1997 ; Piškur et al., 2006 ; Conant y Wolfe, 2007 ; Hagman et al., 2013). Sin embargo, a pesar de este conocimiento mecanicista, las fuerzas evolutivas detrás de la aparición del efecto Crabtree siguen sin estar claras. Aquí revisamos las explicaciones del surgimiento del efecto Crabtree desde un punto de vista evolutivo y teórico del juego. Comenzamos dando una introducción del sistema metabólico que subyace al metabolismo respiro-fermentativo de las levaduras.

Figura 1. Metabolismo energético de las levaduras. Las levaduras tienen dos vías para la producción de ATP a partir de glucosa, respiración y fermentación. Ambas vías comienzan con la glucólisis, que da como resultado la producción de dos moléculas de piruvato y ATP por glucosa. En la fermentación, el piruvato se convierte en etanol. Este proceso no produce ATP adicional, pero recicla el NAD + consumido en la glucólisis y, por lo tanto, proporciona una forma de producción de ATP independiente del oxígeno. En la respiración, el piruvato se oxida completamente a CO 2a través del ciclo del TCA y la fosforilación oxidativa (OXPHOS), que produce ATP adicional pero requiere oxígeno. Las levaduras Crabtree positivas, a niveles suficientes de oxígeno y glucosa, utilizan la fermentación y la respiración simultáneamente. El etanol que se acumula en el medio ambiente se puede reciclar para la producción de ATP una vez que se ha agotado la glucosa. Sin embargo, este proceso produce menos ATP que la oxidación directa de piruvato porque la síntesis de Acetil-CoA a partir de etanol requiere ATP.

Respiro-fermentación y el efecto Crabtree en levaduras

Los azúcares como la glucosa se convierten en piruvato a través de la glucólisis, una vía metabólica empleada con desviaciones en casi todos los organismos (Berg et al., 2002). En las reacciones iniciales de la glucólisis, se consumen 2 ATP por glucosa y la fructosa 1,6-bisfosfato resultante se transforma en dos azúcares de 3 carbonos. En las reacciones posteriores, los azúcares de 3 carbonos se degradan a piruvato, y cada uno produce 2 ATP y 1 NADH.

El piruvato puede degradarse aún más a través de la vía respiratoria o la vía de fermentación. En la fermentación alcohólica, el piruvato se transforma en etanol mediante piruvato descarboxilasa (Pdc) y alcohol deshidrogenasa (Adh), lo que da como resultado una ganancia neta de 2 ATP por glucosa. Adh recicla el NADH que se forma en la glucólisis más baja de nuevo en NAD + y, por lo tanto, la fermentación alcohólica puede operar en ausencia de oxígeno.

En la vía respiratoria, el piruvato deshidrogenasa (Pdh) transforma el piruvato en acetil-coenzima A, que luego se oxida en el ciclo del TCA a CO 2. Esto produce más GTP, NADH y otras coenzimas reducidas que luego se oxidan en la mitocondria para producir ATP. En general, la vía respiratoria en eucariotas puede producir hasta 38 moléculas de ATP a partir de una molécula de glucosa, incluidas las dos producidas por la glucólisis. Este valor es sustancialmente más bajo para organismos con una relación P / O baja en fosforilación oxidativa. Para S. cerevisiae, donde se ha estimado una relación P / O de aproximadamente 1,2, el rendimiento de respiración resultante es de aproximadamente 18 ATP por glucosa (Verduyn et al., 1991 ; van Gulik y Heijnen, 1995 ;de Kok et al., 2012).

Si bien la capacidad de degradar azúcares a través de la fermentación permite que las levaduras se adapten a ambientes anóxicos, el uso de la fermentación no se limita a tales condiciones. Algunas especies de levadura, como S. cerevisiae, utilizan la fermentación incluso en presencia de oxígeno, cuando las concentraciones de glucosa son suficientemente altas. El uso de la fermentación en presencia de oxígeno y en concentraciones elevadas de glucosa se conoce como efecto Crabtree (Crabtree, 1929). Las levaduras que muestran un efecto Crabtree son positivas para Crabtree; las levaduras que no muestran un efecto Crabtree son negativas para Crabtree. Se dan ejemplos y datos de crecimiento para levaduras Crabtree-positivas y Crabtree-negativas en Hagman et al. (2013).

El efecto Crabtree puede demostrarse fácilmente en quimiostato (Postma y Verduyn, 1989) y cultivo discontinuo (Verduyn et al., 1984). En cultivo de quimiostato limitado en glucosa y a bajas tasas de dilución, la producción de CO 2 es igual a la absorción de O 2. El rendimiento de biomasa es alto en tales condiciones (aproximadamente 0,5 g / g) y la concentración de glucosa residual es baja. A medida que aumenta la tasa de dilución, la población se ve obligada a replicarse más rápidamente para mantener un tamaño de población en estado estable en el quimiostato. Esto implica un aumento de la concentración de glucosa residual. Tanto la producción de CO 2 como la de O 2la absorción aumenta con el aumento de la tasa de dilución, pero permanece acoplada hasta que se alcanza un punto crítico. Cuando la velocidad de dilución aumenta en este punto crítico, comienza la fermentación. La producción de CO 2 aumenta rápidamente y se desacopla de la absorción de O 2. El inicio de la fermentación se acompaña de una fuerte disminución del rendimiento de biomasa a valores por debajo de 0,2 g / g (Postma y Verduyn, 1989).

La absorción de O 2 permanece constante (Postma y Verduyn, 1989) o incluso declina (Van Hoek et al., 1998). Esto concuerda con la opinión de que la respiración se limita a una frecuencia máxima; si hay más azúcar disponible de la que se puede procesar mediante la respiración, se fermenta. Además, la disminución de la frecuencia respiratoria sugiere que la capacidad limitada de respiración no es una restricción "estática". Es probable que refleje los costos de expresión de las enzimas y el espacio limitado de la membrana que está disponible para albergar las enzimas involucradas en la fosforilación oxidativa. Estos factores podrían determinar un límite superior para el flujo a través de la respiración y favorecer una tasa de respiración reducida una vez que se inicia la fermentación (se revisan explicaciones alternativas y más detalladas en Molenaar et al., 2009).

Los experimentos de cultivo por lotes (Verduyn et al., 1984) permiten el establecimiento de la concentración de glucosa a la que comienza la fermentación. Para S. cerevisiae, esto se ha demostrado que ocurre a una concentración de glucosa de aproximadamente 150 mg / l (en comparación, el la tasa de absorción de glucosa comienza a saturarse alrededor de 500 mg / l), aunque esto puede variar de una especie a otra y depende de las condiciones específicas. La fuerte caída en el rendimiento de biomasa asociada con la fermentación plantea la pregunta de por qué las levaduras Crabtree positivas utilizan la vía de fermentación “derrochadora” si en principio pudieran depender únicamente de la respiración para la producción de ATP.

Evolución del efecto Crabtree

Un evento importante en la evolución del linaje de S. cerevisiae fue la duplicación del genoma completo (Wolfe y Shields, 1997 ; Kellis et al., 2004) que ocurrió hace aproximadamente 100 millones de años (mya) y duplicó el número de cromosomas de 8 a 16. El momento de la duplicación del genoma completo (WGD) coincide con la diversificación de las angiospermas (Wing y Boucher, 1998), lo que podría haber proporcionado un nuevo nicho para las levaduras ancestrales. Por lo tanto, se ha argumentado que un aumento del flujo en la glucólisis ha sido un resultado evolutivo beneficioso del WGD (Liti y Louis, 2005 ; Merico et al., 2007). Por otro lado, un análisis comparativo de especies de levadura que abarca más de 150 millones de años de historia evolutiva de la levadura también ha demostrado que, si bien los linajes posteriores a la WGD tienen un efecto Crabtree pronunciado, la fermentación aeróbica no se limita a estos linajes (Merico et al., 2007).). Es probable que varios eventos evolutivos adicionales hayan contribuido a dar forma al metabolismo del azúcar de las levaduras y se revisan en Conant y Wolfe (2007) ; Merico y col. (2007) ; Hagman y col. (2013).

Un evento que ha recibido especial atención es la duplicación de la alcohol deshidrogenasa, dando lugar a dos enzimas distintivas, Adh1 y Adh2. Este evento de duplicación ha dado lugar a una vía de explicación para el uso de fermentación "derrochadora" por levaduras positivas para Crabtree, una teoría a la que se hace referencia como la estrategia "hacer-acumular-consumir" (Piškur et al., 2006). La idea detrás de la estrategia de “hacer-acumular-consumir” (en resumen, MAC) es que las levaduras fermentan la glucosa para defender los recursos ricos en azúcar como la fruta de los competidores explotando la toxicidad del etanol. Además, el etanol se puede consumir más tarde, una vez que se hayan agotado los carbohidratos preferidos. Debido al bajo rendimiento resultante de ATP y biomasa, la fermentación en sí misma se considera un desperdicio y "energéticamente costosa" (Thomson et al., 2005): incluso cuando no se pierde etanol en el medio ambiente y todo se puede reciclar, existe una pérdida en términos de ATP debido a la conversión de etanol en acetil-CoA por la aldehído deshidrogenasa (Ald) y acetil-CoA sintetasa (Acs), que requiere un ATP adicional por etanol (ver Figura 1).

Esta explicación para el uso de la fermentación aeróbica fue motivada específicamente por el trabajo de resucitar hipotéticos ancestros comunes de Adh1 y Adh2 (Thomson et al., 2005). Los parámetros cinéticos enzimáticos sugieren que Adh 1 es más competente en la excreción de etanol, mientras que Adh 2 es más competente en la absorción de etanol. Se ha demostrado que la cinética del Adh ancestral resucitado se asemeja a la cinética de Adh1 en lugar de Adh2. Se ha argumentado que el papel de los Adh ancestrales era excretar etanol en condiciones anaeróbicas, en lugar de consumirlo. Con base en esto se afirma que antes de la duplicación de Adh, la levadura ancestral no consumía etanol, por lo que la levadura ancestral no acumulaba etanol en condiciones aeróbicas; La fermentación aeróbica evolucionó después de la duplicación de Adh.

Una visión alternativa con respecto a las ventajas y desventajas de la fermentación aeróbica se basa en las compensaciones que surgen entre la tasa y el rendimiento de producción de ATP y, en consecuencia, entre la tasa de crecimiento y el rendimiento de un organismo. Este punto de vista ha sido delineado conceptualmente por Pfeiffer et al. (2001), y se conoce como la hipótesis de compensación entre tasa y rendimiento (en breve, RYT). Mientras que el rendimiento de ATP es la cantidad de ATP producida por unidad de sustrato, la tasa de producción de ATP es la cantidad de ATP producida por unidad de tiempo. Una compensación entre la tasa de ATP y el rendimiento significa que el ATP puede producirse rápidamente (es decir, a alta tasa y bajo rendimiento) o eficientemente (es decir, a baja tasa y alto rendimiento). Las compensaciones entre la tasa y el rendimiento de la producción de ATP pueden surgir por varias razones, incluidas las limitaciones termodinámicas fundamentales de la producción de ATP (Pfeiffer y Bonhoeffer, 2002) y las limitaciones mecánicas de una vía metabólica energética determinada, como los costos impuestos por los intermedios o enzimas de una vía (Heinrich y Schuster, 1996 ; Pfeiffer y Bonhoeffer, 2004).

En el metabolismo respiro-fermentativo de las levaduras, la restricción mecanicista relevante parece ser la capacidad limitada de la vía respiratoria para producir ATP, que como se discutió anteriormente, probablemente refleja los costos y las restricciones para la expresión de las enzimas involucradas en la respiración, y el espacio limitado de la membrana.. Cuando se dispone de más azúcar de la que se puede procesar mediante la respiración, son factibles dos estrategias: (i) procesar azúcar adicional a través de la vía de fermentación; o (ii) abstenerse de procesar el azúcar adicional a través de la vía de fermentación. La primera opción es implementada por levaduras Crabtree-positivas, la segunda por levaduras Crabtree-negativas. Debido a que la fermentación de glucosa adicional aumenta la tasa de producción de ATP pero reduce el rendimiento general de ATP, la primera opción puede verse como una estrategia rápida pero ineficiente. mientras que la segunda opción puede verse como una estrategia lenta pero eficiente. Según RYT, para muchos microorganismos bajo una amplia gama de condiciones ambientales, la tasa es más relevante para la aptitud competitiva que el rendimiento. En otras palabras, las levaduras Crabtree-positivas usan fermentación aeróbica porque la tasa aumentada de producción de ATP proporciona una ventaja selectiva; la disminución del rendimiento tiene poca relevancia para la aptitud.

La hipótesis de la compensación de velocidad / rendimiento no excluye que la toxicidad del etanol pueda contribuir a la ventaja selectiva de la fermentación aeróbica. Sin embargo, MAC y RYT difieren en un punto crucial: si la fermentación proporciona o no una ventaja selectiva a través de una mayor tasa de producción de ATP. Si la fermentación proporciona una ventaja selectiva que es independiente de la toxicidad del etanol, RYT proporciona una explicación suficiente para la aparición del efecto Crabtree. Los efectos anticompetidores del etanol podrían haber proporcionado beneficios adicionales, pero estos beneficios no son necesarios para explicar la aparición del efecto Crabtree.

Como se describió anteriormente, la evidencia proporcionada en apoyo de MAC proviene de análisis comparativos de levadura (Piškur et al., 2006 ; Merico et al., 2007 ; Rozpęedowska et al., 2011 ; Hagman et al., 2013), el estudio de la propiedades cinéticas del Adh ancestral (Thomson et al., 2005) y la aparente desventaja de una menor eficiencia energética de la fermentación aeróbica. Además, dado que el etanol puede matar a los competidores microbianos, parece plausible que surgiera la fermentación alcohólica porque permite que las levaduras defiendan los recursos. Sin embargo, no existe apoyo directo para la opinión de que la ventaja selectiva de la fermentación aeróbica se basa en la toxicidad del etanol.

Hay observaciones que indican que los efectos tóxicos sobre los competidores no son una explicación suficiente para la fermentación aeróbica. Las levaduras Crabtree-positivas se mantienen y se han mantenido en monocultivo, en ausencia de especies microbianas competidoras, para aplicaciones industriales, en laboratorios de investigación y en experimentos controlados de evolución a largo plazo (Ferea et al., 1999 ; Jasmin et al., 2012). Hasta donde sabemos, la pérdida de fermentación no se ha observado en tales condiciones, aunque esto se espera si la fermentación es energéticamente costosa y los beneficios surgen únicamente de los efectos tóxicos del etanol sobre los competidores. En principio, podría conseguirse fácilmente una pérdida de fermentación aeróbica. Variantes negativas de Crabtree de S. cerevisiaese puede construir fácilmente eliminando parte del repertorio de transportadores de hexosa de la levadura (MacLean y Gudelj, 2006). Los experimentos de competición entre estas construcciones y el tipo salvaje proporcionan apoyo para RYT.

Un argumento adicional en contra del MAC es que el etanol ya se produce en concentraciones comparativamente bajas de glucosa (por debajo de 1 g / l), donde el etanol no puede acumularse a niveles tóxicos que típicamente están en un rango de varios gramos por litro (Casey e Ingledew, 1986).. Además, los cambios entre las vías metabólicas de la energía no solo se observan en el metabolismo respiro-fermentativo de las levaduras, sino en varios sistemas metabólicos, incluidas las células tumorales (Warburg, 1956 ; Molenaar et al., 2009) y los sistemas bacterianos (Molenaar et al.., 2009) e involucran una gama de productos finales que no son necesariamente tan tóxicos como el etanol. Esto destaca la necesidad de una explicación más universal de los cambios metabólicos.

Sin embargo, la evidencia experimental directa de RYT en el contexto del metabolismo energético de la levadura también ha permanecido esquiva. Un enfoque ideal sería exponer una población de S. cerevisiae a la selección por rendimiento. Con base en RYT, uno esperaría que la fermentación se pierda a medida que la población evoluciona hacia un rendimiento creciente y que la fermentación se restablece después de la selección posterior por velocidad. Desafortunadamente, tales experimentos no se han realizado con levadura porque los regímenes experimentales que seleccionan por rendimiento son mucho más difíciles de implementar que los regímenes experimentales que seleccionan por tasa. Sin embargo, recientemente, se ha desarrollado una configuración experimental prometedora para la selección de rendimiento basada en emulsiones inversas, y los resultados de Lactococcus lactis apoyan las compensaciones de tasa / rendimiento en este sistema (Bachmann et al., 2013). Queda por probar si se pueden obtener resultados similares para las levaduras.

Consideraciones sobre la teoría del juego

La teoría de juegos es una herramienta matemática para estudiar las interacciones entre "jugadores" en juegos estratégicos (Von Neumann y Morgenstern, 1944). Se ha demostrado que es una herramienta valiosa para comprender las interacciones sociales entre organismos, incluidos los microorganismos (Nowak y Sigmund, 2004 ; Pfeiffer y Schuster, 2005 ; West et al., 2006).). En lugar de ver los procesos evolutivos como una optimización de la aptitud que impulsa a las poblaciones a moverse cuesta arriba en un panorama de aptitud estática, la teoría de juegos explica el hecho de que las estrategias de los jugadores pueden cambiar el panorama de la aptitud. De este modo se crea un paisaje dinámico, donde correr cuesta arriba no significa necesariamente que uno pueda llegar a una cima. En la teoría de juegos evolutivos, la noción de optimalidad es reemplazada por estrategias evolutivas estables (ESS) (Maynard Smith y Price, 1973). En una población en la que todos los jugadores juegan la estrategia ESS, cualquier mutante con una estrategia diferente tiene una desventaja de aptitud física y, por lo tanto, no puede invadir la población ESS. No se garantiza que exista un ESS para un sistema dado, como se ilustra en el juego Piedra-Tijera-Papel (Figura 2). Las aplicaciones de la teoría de juegos a la evolución de los sistemas bioquímicos se han revisado previamente (Pfeiffer y Schuster, 2005).

Figura 2. Dinámica Piedra-Tijera-Papel de la producción de toxinas. En el juego Piedra-Tijera-Papel, dos jugadores pueden elegir simultáneamente entre tres estrategias, "Piedra", "Tijera" y "Papel". Cada estrategia vence y es derrotada por otra estrategia: "Roca" vence a "Tijeras", "Tijeras" vence a "Papel" y "Papel" vence a "Roca". En este juego no hay ESS, ya que ninguna estrategia puede dominar las otras estrategias (Kerr et al., 2002 ; Nowak y Sigmund, 2004 ; Biernaskie et al., 2013). Piedra-Papel-Tijera se ha analizado a través de modelos (Károlyi et al., 2005 ; Prado y Kerr, 2008 ; Biernaskie et al., 2013) y experimentalmente en sistemas vegetales (Lankau y Strauss, 2007 ; Cameron et al., 2009), sistemas bacterianos (Kerr et al., 2002 ; Nahum et al., 2011) y lagartos (Sinervo, 2001). En particular, se ha demostrado que la producción de toxinas en sistemas microbianos sigue las reglas de Piedra-Papel-Tijera (Kerr et al., 2002 ; Nahum et al., 2011). En este sistema, la producción de toxinas es costosa, al igual que la resistencia. Una cepa productora de toxinas puede competir con una cepa que es susceptible a la toxina. Una cepa resistente puede competir con la cepa productora de toxinas porque es resistente, pero no paga los costos de producción de la toxina. En ausencia de un productor de toxinas, la cepa susceptible puede competir con la cepa resistente porque no paga los costos de la resistencia, completando así el ciclo de invasibilidad mutua. Si la producción de etanol y la resistencia al etanol son características costosas, se podría esperar que la dinámica Piedra-Papel-Tijera influya en las interacciones entre las levaduras Crabtree-positivas y Crabtree-negativas.

Desde la perspectiva de la teoría de juegos, MAC y RYT tienen características muy diferentes. Si la fermentación aeróbica es costosa (excluyendo los efectos beneficiosos de la toxicidad del etanol), la producción de etanol podría verse como la creación de un bien público; En el pasado se han identificado numerosos casos similares de producción de bienes públicos por microbios (West et al., 2006). Esto implica que una población en fermentación sería propensa a la invasión de un "tramposo" que se beneficia de la producción de etanol de otros pero no paga los costos de producción de etanol. La producción de etanol no constituiría una estrategia evolutiva estable. Teniendo en cuenta las diferencias hipotéticas en la susceptibilidad / resistencia al etanol, la MAC tal vez podría conducir a un ciclo de estrategias, como se observa para otros sistemas de toxinas anticompetitivas (ver Figura 2). En contraste, RYT ve la fermentación aeróbica como una estrategia que destruye los bienes públicos debido a su ineficiencia: si bien el uso eficiente de los recursos es un rasgo que beneficia a nivel de grupo o población, pero no para el organismo individual, el uso ineficiente de recursos es una desventaja para el grupo / población pero ventajoso para el individuo (ver Figura3). Queda por investigar si estas diferencias pueden explotarse experimentalmente para determinar si MAC o RYT describen los costos y beneficios del efecto Crabtree de manera más apropiada.

Figura 3. Eficiencia en el uso de recursos: un juego de bienes públicos. En un juego de bienes públicos (o Tragedy of the Commons, Hardin, 1968), varios jugadores pueden invertir en un bien público. Los rendimientos de la inversión se comparten entre todos los jugadores, independientemente de la inversión. Sin ningún mecanismo adicional implementado, los jugadores que se abstienen de invertir recibirán una recompensa neta mayor que los jugadores que invierten. En la figura, por ejemplo, las inversiones se duplican y luego se dividen equitativamente entre todos los jugadores. 4 jugadores (que se muestran en azul) invierten $ 10, uno no invierte (que se muestra en rojo); todos reciben una devolución de $ 16. La recompensa neta para los jugadores que invierten ($ 6 = $ 16 - $ 10) es menor que la recompensa para el jugador que no invierte ($ 16 = $ 16 - $ 0). El bien estudiado dilema del prisionero (Rapoport, 1965) puede verse como una versión para 2 jugadores del Public Goods Game. Para los microorganismos, se han identificado una serie de características que pueden potencialmente crear bienes públicos, por ejemplo, la excreción de exoenzimas como la invertasa (Greig y Travisano, 2004 ; West et al., 2006). Se ha demostrado que las compensaciones entre tasa y eficiencia en el uso de recursos compartidos conducen a un juego de bienes públicos. En el contexto de RYT, esto implica que la fermentación aeróbica puede verse como un rasgo egoísta (Pfeiffer et al., 2001).

Paisajes de aptitud metabólica

La tasa, el rendimiento y la toxicidad de los productos finales son plausibles, pero no necesariamente las únicas propiedades relevantes para la aptitud de una vía metabólica. Aparte del etanol, la fermentación también conduce a la producción de calor, que a su vez podría tener un efecto perjudicial sobre los competidores (Goddard, 2008). Otros factores potencialmente relevantes pueden incluir los costos pagados por sintetizar las enzimas de una vía, por el espacio que ocupan las enzimas (especialmente para las enzimas unidas a la membrana), por las limitaciones osmóticas impulsadas por los intermediarios de una vía metabólica (Heinrich y Schuster, 1996). ; Pfeiffer y Bonhoeffer, 2004 ; Molenaar et al., 2009 ; Zhuang et al., 2011 ; Goel et al., 2012), y por los efectos de productos secundarios dañinos como las especies reactivas de oxígeno (ROS) formadas en la respiración (Slavov et al., 2014). Además, un enfoque en las propiedades de las vías productoras de ATP (catabólicas) descuida el papel del anabolismo. Con el aumento de la tasa de producción de ATP, los procesos que consumen ATP (anabólicos) como la síntesis de ribosomas y proteínas podrían restringir cada vez más el crecimiento (Scott et al., 2010 ; Kussell, 2013). En general, se puede considerar que los sistemas metabólicos y los cambios en el uso de las vías metabólicas reflejan un conjunto de restricciones dependientes de la condición en la "economía celular" (Molenaar et al., 2009). Dentro de este contexto, RYT y MAC son explicaciones relativamente simplistas que se centran en (y discrepan sobre) el factor más importante y relevante para la aptitud física detrás del efecto Crabtree.

La investigación de los costos y beneficios detallados asociados con los rasgos metabólicos sigue siendo un campo prometedor para la investigación futura, al igual que los enfoques más completos para estudiar la diversidad de estrategias metabólicas utilizadas por los microbios. En el contexto de las levaduras, iluminará el origen de un rasgo fundamental en el metabolismo energético de gran relevancia para la vinificación y la fermentación industrial. En un contexto más general, tal agenda de investigación es de importancia para campos de investigación que van desde la metabolómica (por ejemplo, para predicciones de distribución de flujo) (Schuster et al., 2008 ; Molenaar et al., 2009) hasta la teoría social evolutiva de micro organismos (Pfeiffer et al., 2001 ; Pfeiffer y Bonhoeffer, 2004 ;Pfeiffer y Schuster, 2005 ; MacLean y Gudelj, 2006 ; Schuster et al., 2008). Además, generaría una mejor comprensión de las estrategias metabólicas utilizadas por las células tumorales (DeBerardinis et al., 2008 ; Diaz-Ruiz et al., 2011); después de todo, el metabolismo de las células tumorales fue uno de los puntos de partida que condujeron al descubrimiento de el efecto Crabtree hace casi cien años (Crabtree, 1929).

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Referencias

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Palabras clave: metabolismo energético de la levadura, efecto Crabtree, evolución del metabolismo, respiro-fermentación, teoría de juegos evolutivos.

Cita: Pfeiffer T y Morley A (2014) Una perspectiva evolutiva sobre el efecto Crabtree. Parte delantera. Mol. Biosci. 1 : 17. doi: 10.3389 / fmolb.2014.00017

Recibido: 4 de julio de 2014; Aprobado: 26 de septiembre de 2014;

Publicado en línea: 21 de octubre de 2014.

Editado por:

Thomas Nägele, Universidad de Viena, Austria

Revisado por:

Luciana Hannibal, Cleveland Clinic, EE. UU.

Bas Teusink, VU University Amsterdam, Países Bajos

Copyright © 2014 Pfeiffer y Morley. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de atribución Creative Commons (CC BY). Se permite el uso, distribución o reproducción en otros foros, siempre que se acredite al autor (es) original (es) o al licenciante y se cite la publicación original en esta revista, de acuerdo con la práctica académica aceptada. No se permite ningún uso, distribución o reproducción que no cumpla con estos términos.

* Correspondencia: Thomas Pfeiffer, Instituto de Estudios Avanzados de Nueva Zelanda, Universidad de Massey, Private Bag 102904, North Shore Mail Centre, Auckland 0745, correo electrónico de Nueva Zelanda: t.pfeiffer@massey.ac.nz

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2014.00017/full

Fisiología, ecología y aplicaciones industriales de la formación de aromas en levaduras.

Maria C Dzialo, 1, 2 Rahel Park, 1, 2 Jan Steensels, 1, 2 Bart Lievens, 3 y Kevin J Verstrepen 1, 2

Resumen

Las células de levadura se emplean a menudo en procesos de fermentación industrial por su capacidad para convertir de manera eficiente concentraciones relativamente altas de azúcares en etanol y dióxido de carbono. Además, las células de levadura fermentadas producen una amplia gama de otros compuestos, incluidos varios alcoholes superiores, compuestos carbonílicos, compuestos fenólicos, derivados de ácidos grasos y compuestos de azufre. Curiosamente, muchos de estos metabolitos secundarios son volátiles y tienen aromas penetrantes que a menudo son vitales para la calidad del producto. En esta revisión, resumimos las diferentes vías bioquímicas que subyacen a la producción de aromas en la levadura, así como la relevancia de estos compuestos para aplicaciones industriales y los factores que influyen en su producción durante la fermentación. Además, discutimos las diferentes funciones fisiológicas y ecológicas de los metabolitos aromáticos activos,

INTRODUCCIÓN

Cuando se les presentan los nutrientes apropiados, las levaduras producen ramos complejos de compuestos aromáticos que incluyen ésteres, alcoholes superiores, carbonilos, derivados de ácidos grasos y compuestos de azufre. Además, aunque las levaduras no sintetizan directamente, los tioles y monoterpenos volátiles a veces se liberan de precursores inodoros mediante enzimas derivadas de la levadura (Tominaga et al. 1998; Moreira et al. 2005 ). Nuestro conocimiento del proceso de fermentación y la producción de aroma asociado por la levadura ha aumentado exponencialmente durante los últimos siglos, desde el descubrimiento de las células de levadura en 1680, hasta la secuenciación de todo el genoma de Saccharomyces cerevisiae hace apenas dos décadas (Goffeau et al. 1996.), y culminando con una mirada en profundidad a la diversidad fenotípica y genética de casi 200 levaduras industriales el año pasado, incluido un perfil detallado de las diferencias en la formación de aromas (Gallone et al. 2016; Gonçalves et al. 2016 ). Curiosamente, estos estudios recientes demuestran que los humanos han ayudado a impulsar la domesticación de las levaduras, al menos en parte basándose en su capacidad para producir selectivamente los aromas deseados y reducir los compuestos no deseados.

Dada su importancia en la calidad del producto, se ha dedicado mucho esfuerzo a afinar la producción de sabor mediante la levadura en un entorno industrial. A nivel mundial, se pueden aplicar dos enfoques para dirigir la fisiología de la levadura para alterar la producción de aroma: ajustar el entorno de fermentación o modificar el genotipo de la cepa de producción. Ajustar los parámetros ambientales puede ser una forma conveniente, a menudo muy poderosa, de optimizar la producción sin procedimientos biotecnológicos complejos ni un conocimiento profundo de la fisiología básica de la levadura. Sin embargo, dada la reciente expansión de la biodiversidad de levaduras disponible, las estrategias para modificar las levaduras y la caja de herramientas genéticas para diseñar genéticamente cepas, los biotecnólogos ahora pueden seleccionar o desarrollar nuevas levaduras con propiedades aromáticas mucho más allá de lo que se puede lograr mediante el ajuste de parámetros ambientales.

Si bien los humanos han avanzado y perfeccionado la explotación del aroma de la levadura durante varios milenios, seguía sin conocerse por qué las células de levadura producen estas moléculas de sabor activo en primer lugar. Durante las últimas décadas, se han propuesto varias hipótesis para posibles roles fisiológicos, incluida la síntesis de bloques de construcción celulares específicos, el equilibrio redox y las reacciones de desintoxicación, pero la evidencia de estos sigue siendo muy limitada. Sin embargo, estudios recientes han comenzado a descubrir un papel fundamental y central de la producción de aromas en el estilo de vida de la levadura. Específicamente, se ha demostrado que los volátiles derivados de la levadura pueden tener funciones integrales en entornos naturales, que van desde la señalización de la información hasta los vectores animales, la regulación del crecimiento de hongos y la comunicación entre células de levadura o colonias (Richard et al.1996; Bruce y col. 2005; Leroy y col. 2011; Davis y col. 2013 ). La interacción entre levaduras e insectos se ha estudiado intensamente durante la última década y hay cada vez más pruebas de que la atracción de muchas especies de insectos por las frutas en fermentación está mediada por los volátiles emitidos por las levaduras y no por la propia fruta (Becher et al. 2012 ).

En esta revisión, proporcionamos una descripción general de la comprensión actual de la producción de aromas en levaduras en un contexto industrial, fisiológico y ecológico. Intentamos proporcionar una revisión más global que cubra los principales compuestos que se discuten comúnmente en la industria y la ecología ​(Figura 1). Para cada categoría de metabolito, primero ilustramos las vías bioquímicas que son cruciales para comprender la razón fundamental detrás de gran parte de la investigación industrial. Tenga en cuenta que gran parte de la revisión bioquímica en este artículo se referirá a Saccharomyces cerevisiaeya que la investigación de los mecanismos específicos del proceso de fermentación se basa comúnmente en esta especie, dado su papel central como organismo modelo y como fermentador robusto en la industria. Luego discutimos las funciones industriales de los compuestos aromáticos que han desarrollado los humanos. También destacamos los parámetros ambientales clave, como la temperatura y la composición del medio, que comúnmente se ajustan para afectar la producción de compuestos específicos, así como algunas modificaciones en los antecedentes genéticos que se han desarrollado para influir en la producción de aromas. Por último, exploramos algunos de los posibles roles fisiológicos y ecológicos de estos compuestos aromáticos.

Figura 1.

Descripción general de la producción de compuestos aromáticos. Esta revisión cubre una gran variedad de compuestos aromáticos producidos durante la fermentación de la levadura. La fermentación básica del piruvato (verde / rojo) conduce a varios compuestos a base de carbono, incluidos el etanol y el dióxido de carbono. El piruvato también se alimenta del anabolismo de los aminoácidos, lo que lleva a la producción de dicetonas vecinales (rosa). El metabolismo de los aminoácidos es responsable de numerosos compuestos aromáticos, incluidos los alcoholes y ésteres superiores (violeta), así como los compuestos que contienen azufre (azul). Además, los compuestos fenólicos se derivan de moléculas que se encuentran en los medios (naranja). Los compuestos que se muestran en tonos más oscuros se consideran intermedios, mientras que los tonos más claros son compuestos aromáticos discutidos en esta revisión. Las líneas punteadas indican la importación / exportación de compuestos, las líneas continuas representan reacciones bioquímicas (no indica el número de reacciones).

METABOLITOS DE FERMENTACIÓN PRIMARIA: ETANOL

En muchos procesos de fermentación industrial, el etanol es el compuesto más importante producido por la levadura. Además, es la producción de este metabolito primario lo que originalmente despertó el interés por la fermentación de bebidas. Las primeras civilizaciones desarrollaron métodos de fermentación para aprovechar los beneficios del etanol; el etanol prolonga la vida útil, mejora la digestibilidad y actúa como euforizante (Alba-Lois y Segal-Kischinevzky 2010 ). Hoy en día, el etanol todavía forma la base de muchos productos fermentados, ya sea destinados al consumo o a la energía renovable. Además, el etanol es un compuesto aromático volátil, aunque sus propiedades sensoriales son quizás menos pronunciadas que algunas de las moléculas más sabrosas que también se forman como subproductos de la vía de fermentación.

Bioquímica de la producción de etanol

Aunque las levaduras se han utilizado por su capacidad fermentativa durante milenios, los componentes moleculares de esta vía básica solo se descubrieron en las últimas décadas (Bennetzen y Hall 1982; Schmitt, Ciriacy y Zimmermann 1983 ).

El metabolismo central comienza con la conversión básica de azúcares en piruvato, produciendo energía en forma de ATP y cofactores reducidos de NADH. La divergencia del piruvato después de la glucólisis es un punto regulador esencial en el metabolismo, lo que lo ha convertido en un punto clave para la investigación bioquímica e industrial. Hay dos direcciones básicas que el piruvato puede tomar en este punto: fermentación o respiración. En la mayoría de los eucariotas, esto depende de la presencia de oxígeno. En condiciones aeróbicas, el piruvato se convertirá en acetil-coA por acciones de una piruvato deshidrogenasa y se dirigirá hacia el ciclo del ácido cítrico ​(Figura 2). En condiciones fermentativas (anaeróbicas), el piruvato se desvía hacia la fermentación.

Figura 2.

Producción de etanol, acetaldehído, ácido acético y CO 2. Los carbonos fermentables se asimilan del medio y se convierten en glicerol o piruvato a través de la glucólisis. El piruvato se puede transportar hacia el ciclo de TCA y la respiración (izquierda) o hacia la fermentación alcohólica (derecha). Para algunas conversiones, múltiples enzimas pueden realizar la reacción y se indican en la figura. Nota: Ald4, Ald5 y Adh3 son enzimas mitocondriales pero realizan las mismas reacciones que las otras enzimas citosólicas ALD y ADH.

La conversión de piruvato en etanol es un proceso de dos pasos. Primero, el piruvato se convierte en acetaldehído mediante una piruvato descarboxilasa (PDC), liberando dióxido de carbono como desecho. Hay tres confirmados enzimas de PDC codificados en el Saccharomyces cerevisiae genoma (Base de datos del Genoma de Saccharomyces; cereza et al. 2012 ). Estas enzimas actúan como un punto de ramificación metabólico clave entre la fermentación y la respiración. En competencia directa con la piruvato deshidrogenasa, las PDC pueden eliminar el exceso de piruvato de la vía y desviarlo hacia la producción de etanol.

Posteriormente, el acetaldehído se convierte en etanol mediante una alcohol deshidrogenasa (ADH). Este tipo de oxidorreductasa puede catalizar la interconversión reversible de alcoholes y los correspondientes aldehídos o cetonas. La amplia gama de sustratos disponibles para las ADH a lo largo de las vías metabólicas requiere una regulación sustancial para asegurar un equilibrio de los productos e intermedios deseados. Por lo tanto, no es sorprendente que los eucariotas, incluso los humanos, tengan numerosas enzimas ADH. Incluso un eucariota simple como S. cerevisiae tiene siete genes ADH, así como varias aril-alcohol deshidrogenasas (AAD). Adh1 es la enzima principal para producir etanol durante la fermentación y para reponer la reserva de NAD +, mientras que Adh2 es reprimible por glucosa y oxidará el etanol como fuente de carbono cuando sea necesario (Leskovac, Trivić y Pericin 2002 ). Adh3 se expresa constitutivamente tanto durante la producción como durante la utilización de etanol, pero como se expresa en las mitocondrias, es probable que su función principal mantenga el equilibrio redox (Bakker et al. 2001; de Smidt, du Preez y Albertyn 2012 ).

Etanol en la industria

El etanol es un metabolito de levadura importante para la mayoría de los productos que involucran fermentación de levadura. Es un ingrediente vital de las bebidas fermentadas y se usa como un biocombustible renovable prominente, pero el etanol también juega un papel en la calidad del producto de otros productos fermentados donde la conexión es quizás más oscura. Por ejemplo, durante el horneado, el etanol producido por la levadura tiene un fuerte impacto en la extensibilidad de la masa y la aglomeración del gluten (Jayaram et al. 2014 ). Durante las fermentaciones del cacao, el etanol producido por la levadura sirve como fuente de carbono para las bacterias del ácido acético (que son vitales para el sabor del cacao) y desencadena reacciones bioquímicas dentro del grano de cacao que conducen a la producción de diversos aromas y precursores del aroma (Hansen, del Olmo y Burri 1998).

Dado el papel central del etanol en los procesos de fermentación alcohólica, muchas investigaciones se han centrado en mejorar la velocidad y la eficiencia de la producción de alcohol por las levaduras durante las últimas décadas, especialmente en la industria del bioetanol. Curiosamente, también existe una tendencia emergente hacia las bebidas fermentadas con contenido reducido de etanol (Wilkinson y Jiranck 2013; OMS 2014). Esto se debe a la creciente demanda tanto de los consumidores como de los productores para reducir los problemas asociados con los altos niveles de alcohol. Demasiado etanol puede comprometer la calidad del producto y la ingesta excesiva de alcohol se asocia con varios problemas de salud. Desde un punto de vista financiero, un alto contenido de alcohol puede aumentar los costos para el consumidor en países donde los impuestos se calculan en función del contenido de etanol.

Parámetros ambientales y producción de etanol

La modificación de los parámetros de fermentación, incluidas las fuentes de carbono, los oligoelementos e incluso la temperatura, ha demostrado ser una medida eficaz para alterar la producción de etanol por las levaduras industriales (Tabla 1).

Tabla 1.

Efecto de los parámetros ambientales en la producción de etanol.

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de etanol	Referencia
La temperatura	Por encima del óptimo	Disminución (menor tolerancia al etanol)	Coleman et al. (2007)
pH	Incrementar	Aumento (aumento del gradiente electroquímico de protones)	Lam et al. ( 2014 )
Oxígeno	Incrementar	Incremento (mayor viabilidad celular)	Alfenore et al. ( 2004 )
Composición media
Fuente C	Azúcares preferidos (glucosa, sacarosa)	Disminuir (efectos secundarios no deseados sobre la fisiología)	Verstrepen et al. ( 2004 )
Fuente de N	NH 4 , glutamato	Disminuir (en comparación con los aminoácidos)	Albers et al. ( 1996 )
Iones de metal	Suplementacion	Incrementar	Tosun y Ergun ( 2007 )
Vitaminas	Suplementacion	Incrementar	Alfenore et al. ( 2002 )
Lípidos (ácidos grasos, esteroles)	Suplementacion	Incrementar	Pham et al. ( 2010 )
Mezclas ricas en nutrientes	Suplementacion	Incrementar	Jones e Ingledew ( 1994 )
Potasio	Suplementacion	Aumento (aumento del gradiente de la membrana de potasio)	Lam et al. ( 2014 )
Campo eléctrico	Aplicación de 15V	Aumento (fuente alternativa de potencia redox)	Mathew y col. ( 2015 )
Enzima (amilasa)	Suplementacion	Aumentar (más azúcares disponibles)	Nigam y Singh ( 1995 )

Sin embargo, los efectos positivos de estos ajustes medios a menudo dependen de la cepa (Remize, Sablayrolles y Dequin 2000 ), y en el caso de la producción de alimentos, el efecto secundario potencialmente desventajoso sobre el aroma debe evaluarse cuidadosamente. Recientemente se han descrito otras estrategias más aventureras. Por ejemplo, la 'electrofermentación' impone un campo eléctrico sobre la fermentación para que sirva como una fuente alternativa de poder reductor y oxidante (Schievano et al. 2016 ). La aplicación de un potencial estático de hasta 15 V (sin ninguna corriente resultante) a un cultivo de S. cerevisiae dio como resultado un rendimiento de etanol 2 veces mayor (que alcanzó el 14% v / v) y una tasa de fermentación de 2 a 3 veces más rápida (Mathew et al. 2015). En otra estrategia, Lam et al. ( 2014 ) fortalecieron los gradientes opuestos de la membrana electroquímica de potasio y protones durante las fermentaciones, lo que condujo a una mayor resistencia a múltiples alcoholes, incluido el etanol (Lam et al. 2014 ).

Factores genéticos y producción de etanol

Una de las formas más sencillas de obtener levaduras con capacidad de producción de etanol modulada es cribar la biodiversidad natural disponible. La mayoría de los procesos de fermentación se realizan con S. cerevisiae, o especies muy relacionadas, como S. pastorianus (cerveza lager) o S. bayanus (algunos vinos). Se ha demostrado en numerosas ocasiones que rasgos como la tolerancia al etanol o la capacidad de acumulación de etanol dependen de la cepa dentro de S. cerevisiae (Swinnen et al. 2012; Snoek et al. 2015; Gallone et al. 2016.) y la naturaleza a menudo alberga variantes superiores. Por ejemplo, las plantas brasileñas de bioetanol se inocularon inicialmente con levaduras de panadería, pero fueron rápidamente absorbidas por cepas autóctonas silvestres (Basso et al. 2008 ). Estos contaminantes silvestres se han utilizado como cultivos iniciadores comerciales desde entonces. Además, mientras que Saccharomyces spp. siguen siendo el organismo preferido para la mayoría de los procesos de fermentación, las especies alternativas como Brettanomyces bruxellensis, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Saccharomycodes ludwigii y Zygosaccharomyces rouxii producen un aumento (Passoth, Blomqvist y Schnürer 2007; Steensels y Verdeckstreapen 2014 ;et al. 2015 ) o disminuida (Contreras et al. 2015; De Francesco et al. 2015; Morales et al. 2015; Canonico et al. 2016 ) los niveles de etanol, de este modo ampliar aún más la gama de potenciales levaduras industriales.

Sin embargo, numerosos proyectos de investigación han tenido como objetivo modificar la producción de etanol, o la eficiencia de fermentación en general, dentro de una cepa específica alterando el trasfondo genético. Sin embargo, la gran cantidad de enzimas y puntos de ramificación involucrados puede complicar los resultados del ajuste de genes y metabolitos involucrados en el metabolismo del carbono central. La producción de etanol de cepas industriales se ha ajustado mediante varias estrategias, incluida una mayor tolerancia al etanol (Zhao y Bai 2009; Lam et al. 2014; Snoek et al. 2015; Voordeckers et al. 2015; Ohta et al. 2016 ), reducción de la producción de metabolitos alternativos (por ejemplo, glicerol) (Remize, Sablayrolles y Dequin2000; Pagliardini y col. 2013; Hubmann y col. 2013a ) y una mayor capacidad de acumulación de etanol (Pais et al. 2013; Snoek et al. 2015 ).

Durante muchos procesos de fermentación industrial, especialmente en fermentaciones de bioetanol o elaboración de cerveza de alta gravedad, la levadura encuentra concentraciones de etanol extremadamente altas, que a veces alcanzan hasta 20% -25% v / v. Esto puede volverse rápidamente tóxico para las células y, por lo tanto, ha llevado a esfuerzos considerables para aumentar la tolerancia al etanol de las cepas de levadura industriales. Por lo tanto, muchos estudios apuntan a mejorar la tolerancia al etanol. Aquí se destacan algunos enfoques recientes e innovadores (ver Zhao y Bai 2009; Snoek, Verstrepen y Voordeckers 2016 para una descripción más completa). Variaciones naturales en MKT1 (una nucleasa), SWS2 (una proteína ribosómica mitocondrial) y APJ1(un acompañante con un papel en la degradación de proteínas mediada por SUMO), aunque tradicionalmente no está relacionado con la tolerancia al etanol, explica la mayor tolerancia al etanol de la cepa brasileña de bioetanol VR1 (Swinnen et al. 2012 ). Las variaciones en el metaboloma, a saber, la acumulación de valina a través de la deleción de LEU4 y LEU9 (que codifican las enzimas clave que conectan la valina con la síntesis de leucina) o la reducción de los niveles de inositol por la deleción de INM2 (involucrado en la biosíntesis de inositol), también aumentan efectivamente la tolerancia al etanol (Ohta et al. 2016). Se utilizó la ingeniería de maquinaria de transcripción global, una tecnología genética de alto rendimiento, para encontrar variantes del factor de transcripción global Spt1 con mayor tolerancia al etanol (Alper et al. 2006 ). Las versiones mutadas de esta proteína llevaron a una reprogramación transcripcional generalizada cuando se introdujeron en la levadura, y algunos de los mutantes resultantes demostraron una mejor tolerancia al etanol (Alper et al. 2006 ). Otras estrategias de alto rendimiento, como la edición multiplex asistida por TALEN (nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción) y la reorganización del genoma asistida por robot, también han producido mejoras en la tolerancia al etanol de cepas (Snoek et al. 2015; Zhang et al. 2015c.). También se ha demostrado que la evolución a largo plazo es una medida eficaz para aumentar la tolerancia al etanol. Los cultivos de turbidostat cultivados continuamente durante más de 2 años con concentraciones de etanol en aumento gradual produjeron variantes tolerantes con mutaciones en PRT1 (subunidad del factor de iniciación de la traducción eucariota 3), VPS70 (involucrado en la clasificación de proteínas vacuolares) y MEX67 (proteína de unión a poli (A) ARN involucrados en la exportación de ARNm nuclear) (Voordeckers et al. 2015 ).

La modificación de la síntesis de glicerol también puede afectar la producción de etanol. Durante el crecimiento anaeróbico, el glicerol sirve como un 'sumidero de electrones' para volver a oxidar el NADH generado durante la biosíntesis y las concentraciones pueden alcanzar hasta 5 g / L durante las fermentaciones industriales (Nielsen et al. 2013 ). La deleción de los genes de síntesis de glicerol GPD1 y GPD2 disminuye directamente los niveles de glicerol con un aumento resultante de etanol (Nissen et al. 2000 ). Variaciones naturales de GPD1, HOT1 (un factor de transcripción involucrado en la síntesis de glicerol), SSK1 (una proteína fosforilada involucrada en la osmorregulación) y SMP1(un factor de transcripción involucrado en la respuesta al estrés osmótico) también resulta en una disminución de las proporciones de glicerol a etanol durante la fermentación (Hubmann et al. 2013a, b ). Además, la expresión de un GAP dependiente de NADP + no fosforilante reduce la formación de NADH citosólico y da como resultado una disminución de glicerol con un aumento de etanol (Bro et al. 2006 ).

Por último, se puede mejorar la acumulación total de etanol. Este rasgo está relacionado con la tolerancia al etanol, pero diferentes mecanismos moleculares pueden subyacer a ellos (Pais et al. 2013 ). La ingeniería metabólica inversa identificó tres alelos naturales que pueden mejorar la capacidad de acumulación de etanol en la levadura: ADE1 (una nucleótido sintasa), URA3 (una descarboxilasa involucrada en la síntesis de pirimidina) y KIN3 (quinasa involucrada en la tolerancia al etanol) (Pais et al. 2013)). En otro estudio, la mezcla del genoma asistida por robot a gran escala produjo híbridos con una mayor acumulación de etanol de hasta un 7% en relación con una cepa de bioetanol de aplicación generalizada (Ethanol Red), pero no se identificaron los factores genéticos subyacentes (Snoek et al. 2015 ).

Algunos estudios apuntan a reducir la producción de etanol para adaptarse a las tendencias crecientes de bebidas bajas en alcohol. El principal desafío es lograr la reducción de etanol sin perder la calidad del producto, ya que la producción de etanol a menudo está estrechamente relacionada con la producción de otros metabolitos volátiles. Sin embargo, existen métodos para eliminar el etanol durante o después del proceso de fermentación, aunque las estrategias actuales son eficientes, a menudo son costosas o conllevan efectos secundarios no deseados, como un aroma inferior (Varela et al. 2015 ). Las estrategias más nuevas apuntan a limitar la cantidad de etanol producido por la levadura, principalmente alterando el flujo de carbono central o regulando el equilibrio redox (Kutyna et al. 2010; Goold et al. 2017 ). Por ejemplo, eliminación de PDC1o ADH1, la principal línea de producción de etanol, reduce la producción de etanol (Nevoigt y Stahl 1996; Cordier et al. 2007 ). La sobreexpresión de genes de síntesis de glicerol como GPD1 y FPS1 desplaza el flujo de carbono del etanol hacia la síntesis de glicerol (Nevoigt y Stahl 1996; Remize, Barnavon y Dequin 2001; Cambon et al. 2006; Cordier et al. 2007 ).

Funciones fisiológicas y ecológicas del etanol

Las células eucariotas suelen optar por la respiración cuando es posible, ya que ofrece un mayor rendimiento de ATP por molécula de glucosa. Ciertas levaduras, incluida S. cerevisiae, optan por fermentar incluso en presencia de oxígeno (De Deken 1966 ). Este llamado efecto Crabtree es paradójico, ya que el rendimiento energético es significativamente menor. Sin embargo, se cree que la tasa de producción de ATP (cantidad por tiempo) es en realidad mayor a través de la fermentación, lo que permite un crecimiento más rápido. Además, el etanol es altamente tóxico para la mayoría de los otros microbios, lo que puede ayudar a las células de levadura a competir con competidores de crecimiento más rápido (Rozpędowska et al. 2011). Aunque gran parte del flujo metabólico se desvía al etanol, es importante señalar que una fracción del carbono todavía se transporta al ciclo del TCA, que forma importantes precursores del aroma a través de reacciones asociadas con el metabolismo de los aminoácidos.

La producción de etanol mediante la fermentación de células de levadura también puede tener un papel indirecto en la ecología. Varios estudios indican que el etanol influye en el comportamiento de insectos que habitan los mismos nichos naturales. Las moscas de la fruta se sienten fuertemente atraídas por las frutas en descomposición debido a las altas concentraciones de productos de fermentación, incluido el etanol (Becher et al. 2012 ). De hecho, el etanol proporciona una señal matizada para los sitios de oviposición preferenciales entre especies de Drosophila (Diptera: Drosophilidae) estrechamente relacionadas. La tolerancia al etanol de moscas adultas de diferentes especies parece correlacionarse con la preferencia por el sustrato de oviposición rico en etanol (Sumethasorn y Turner 2016 ). Drosophila melanogasteres altamente tolerante al etanol y en condiciones de laboratorio pondrá el doble de huevos en medios ricos en etanol que la D. mauritiana sensible al etanol. Además, las mismas especies de diferentes climas pueden demostrar variaciones tanto en la tolerancia al etanol como en la preferencia de oviposición. Drosophila melanogaster de poblaciones templadas, como Europa, tiene una mayor tolerancia al etanol que las poblaciones de África (Zhu y Fry 2015 ) y las concentraciones más altas de etanol aumentan la frecuencia de oviposición de la mosca europea, pero una frecuencia reducida de las moscas africanas (Sumethasorn y Turner 2016 ).

El efecto del contenido de etanol sobre la oviposición también se ha relacionado con la presencia de avispas parásitas. Drosophila melanogaster aumenta la puesta de huevos en un sustrato rico en etanol cuando hay avispas parásitas en las cercanías (Kacsoh et al. 2013 ). Posteriormente, los huevos puestos por las avispas sufren una mayor mortalidad si el huésped ingiere sustratos ricos en etanol (Milán, Kacsoh y Schlenke 2012) e incluso niveles diluidos de etanol pueden reducir el número total de huevos de parasitoides puestos en las larvas. La preferencia por un sitio de oviposición que contenga etanol puede depender en gran medida de la presencia de fuentes de alimentos libres de etanol adecuadas en las cercanías. Cuando el sustrato alternativo sin etanol está cerca, las moscas prefieren el sustrato que contiene etanol. A medida que aumenta la distancia, la preferencia por el etanol disminuye rápidamente (Sumethasorn y Turner 2016 ). En conjunto, esto sugiere que las moscas de la fruta están reevaluando continuamente las posiciones relativas de los sustratos disponibles, potencialmente para asegurar la supervivencia. Parece que prefieren ambientes hostiles (ricos en etanol) para proteger los huevos y las larvas recién nacidas, pero solo si hay una fuente de alimento adecuada y menos dura cerca para que las larvas la encuentren.

El uso de compuestos producidos microbianamente es un enfoque relativamente reciente y recurrente que se utiliza actualmente como atrayentes para diversas plagas biológicas, y aparecerán varios ejemplos a lo largo de esta revisión. Un ejemplo muy reciente de esta táctica es el uso de mezclas que contienen etanol contra el parásito aviar Philornis downsi (Diptera: Muscidae). Esta mosca nativa de América del Sur ha invadido recientemente Galápagos y sus larvas se han estado alimentando de los polluelos de los famosos pinzones de Darwin (Kleindorfer y Dudaniec 2016 ). Los adultos de Philornis downsi se alimentan de sustratos fermentados, y el etanol juega un papel crucial para guiarlos hacia la fuente de alimento. Cuando el etanol se mezcla con ácido acético, atrae de forma eficaz y específica a P. downsisobre insectos no objetivo (Cha et al. 2016 ). De manera similar, la combinación de etanol y ácido acético se ha sugerido como un señuelo útil y económico para atrapar otros insectos como Muscina stabulans portadora de patógenos (Diptera: Muscidae) y Fannia canicularis (Diptera: Muscidae) (Landolt, Cha y Zack 2015 ), así como la plaga del maíz Carpophilus humeralis (Coleoptera: Nitidulidae) (Nout y Bartelt 1998 ).

Los insectos no son los únicos organismos afectados por el etanol. Originalmente se pensó que habitaba únicamente en el suelo, el nematodo Caenorhabditis elegans se encuentra con frecuencia en frutos, tallos y flores en descomposición (Félix y Braendle 2010 ). Por tanto, es probable que las larvas de C. elegans encuentren etanol procedente de la fermentación microbiana en su entorno natural. Si bien las altas concentraciones de etanol (por encima de 100 mM) dan como resultado un desarrollo más lento, una disminución de la fertilidad y una vida útil más corta (Davis, Li y Rankin 2008 ), en concentraciones más bajas, el etanol parece tener efectos beneficiosos para la supervivencia, prolongando la vida útil de las personas resistentes al estrés. fase larvaria (Castro et al. 2012). Dado que las larvas de nematodos no parecen buscar activamente etanol (Patananan et al. 2015 ), se plantea la hipótesis de que el etanol podría proporcionar una fuente temporal de carbono para asegurar que las larvas sobrevivan hasta que se encuentren las fuentes de alimento adecuadas. Curiosamente, el etanol puede influir negativamente en C. elegans a través de una interacción compleja de múltiples especies: el etanol producido por levadura puede mejorar el crecimiento de varias especies de Acinetobacter y, a su vez, hacerlas más eficientes para resistir e incluso matar a su depredador natural, C. elegans (Smith, Des Etages y Snyder 2004 ).

Ciertos primates también se sienten atraídos por la fermentación de alimentos. Las comunidades microbianas complejas en las fuentes de néctar producen diversos volátiles que los hacen más atractivos para los posibles polinizadores animales. El néctar de la palma bertam ( Eugessona tristis ), una fuente de alimento popular para varios insectos y animales pequeños, puede contener hasta un 3,8% de etanol (Wiens et al. 2008 ). Los estudios de comportamiento indican que estos animales que buscan néctar, específicamente los primates loris perezoso ( Nycticebus coucana ) y el lémur aye-aye ( Daubentonia madagascariensis ), se alimentan preferentemente de néctar que contiene etanol (Gochman, Brown y Dominy 2016 ). Curiosamente, los aye-ayes tienen una mutación en su ADH4gen resultando en un aumento de 40 veces en su metabolismo de etanol en comparación con la mayoría de los primates, lo que podría explicar por qué no se intoxican con la comida con alto contenido de alcohol (Carrigan et al. 2015 ).

METABOLITOS DE FERMENTACIÓN PRIMARIA: CO 2, ACETALDEHÍDO Y ÁCIDO ACÉTICO

Bioquímica de la producción de CO 2, acetaldehído y ácido acético

Como se mencionó, en condiciones fermentativas (anaeróbicas), el piruvato se desvía hacia el etanol en un proceso de dos pasos (Fig. ​(Figura 2).2). El piruvato se convierte primero en acetaldehído con la liberación concomitante de dióxido de carbono (CO 2 ) por el PDC. Las dos principales enzimas PDC, Pdc1 y Pdc5, son las principales contribuyentes a la actividad de descarboxilación en la célula y, por lo tanto, controlan directamente los niveles de acetaldehído y CO 2 (Kulak et al. 2014 ). El Pdc6 se utiliza principalmente durante el crecimiento en fuentes de carbono no fermentables (Hohmann 1991 ). Uno esperaría entonces que en una deleción de PDC1 los niveles de acetaldehído cayeran significativamente. Sin embargo, en ciertas condiciones, la deleción de esta enzima demuestra un aumento de acetaldehído (Curiel et al. 2016). Se plantea la hipótesis de que Pdc5 puede compensar hasta el 70% de la actividad PDC requerida, lo que indica un posible mecanismo compensatorio para mantener el flujo hacia el acetaldehído y la posterior producción de etanol (Wang et al. 2015 ). Además, Pdc5 tiene una actividad específica más alta que puede permitirle competir directamente con la piruvato deshidrogenasa respiratoria y puede ayudar a impulsar más piruvato hacia el etanol (Agarwal, Uppada y Noronha 2013 ).

El acetaldehído puede continuar hacia el etanol a través de la actividad ADH, o puede actuar sobre él una aldehído deshidrogenasa (ALD) para producir ácido acético. Al igual que los ADH, hay varios ALD, lo que amplía aún más el nivel de regulación centrado en el flujo de carbono. Si el acetaldehído se produce citosólicamente, Ald6 o Ald2 puede actuar sobre él; si se produce en las mitocondrias, es convertido por Ald4 o Ald5. Además, una molécula de acetaldehído todavía unida covalentemente al complejo PDC (a través del pirofosfato de tiamina unido) puede interactuar con un acetaldehído adicional para formar acetoína (Fig.​(Figura 22).

Dióxido de carbono en la industria

Si bien los seres humanos no suelen asociar un olor con el dióxido de carbono, su producción es importante en algunos procesos industriales y es detectable por otros organismos (consulte Funciones fisiológicas del CO 2 ). El CO 2 es responsable de la carbonatación natural de las bebidas fermentadas y la producción adecuada de gas es posiblemente el criterio de selección más importante para las levaduras comerciales de panadería, ya que una levadura adecuada requiere una liberación rápida y suficiente de CO 2 (Randez-Gil, Córcoles-Sáez y Prieto 2013 ). Por lo tanto, la mayor parte de la optimización para una mayor velocidad de producción de CO 2 se ha realizado en levaduras de pan.

Parámetros ambientales y producción de CO 2

La mayoría de las fermentaciones de pan solo deben tomar de 1 a 2 h, lo que requiere un inicio rápido del proceso de fermentación para producir de manera rápida y efectiva grandes volúmenes de CO 2. Con este fin, se pueden ajustar varios parámetros de masa para acelerar la producción de CO 2 ​(Tabla 2). La optimización del estado fisiológico de las levaduras antes de introducirlas en la masa puede mejorar drásticamente la capacidad de fermentación. Esto se puede lograr remojando y reactivando así la levadura seca antes de comenzar la fermentación del pan (Gelinas 2010 ). Además, ajustar la forma en que se producen las levaduras secas, por ejemplo, optimizando el medio en el que se cultivan, el momento en el que se cosechan las células de levadura o el protocolo de secado específico, puede aumentar la viabilidad y vitalidad de la levadura durante las fermentaciones del pan. (Galdieri et al. 2010; Rezaei et al. 2014 ).

Tabla 2.

Efecto de los parámetros ambientales en la producción de CO 2 .

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de CO 2	Referencia
La temperatura	Disminuir la T de almacenamiento de la masa con levadura	Disminución	Sasan et al. ( 2012 )
Tiempo de mezcla de la masa	Incrementar	Incrementar	Sahlström y col. ( 2004 )
Composición media
Disponibilidad de la fuente C	Incrementar	Sin embargo, aumenta el riesgo de estrés osmótico.	Sahlström y col. ( 2004 )
Sal	Incrementar	Disminuir (estrés), sin embargo, mejor contención de CO 2	Lynch y col. ( 2009 ), Toyosaki y Sakane ( 2013 )
Mezclas de nutrientes
(salvado de trigo)	Suplementacion	Incrementar	Hemdane et al. ( 2016 )
Enzima (amilasa)	Suplementacion	Aumentar (más azúcares disponibles)	Struyf et al. ( 2017 )

Factores genéticos y producción de CO 2

En general, la capacidad de fermentar azúcares específicos asociados al pan (a saber, maltosa, glucosa, sacarosa y fructosa) se ha alterado para mejorar la producción de CO2, o la capacidad de fermentar, de la levadura de panadería. Uno de los problemas más comunes asociados con la fermentación de la masa es el retraso considerable entre la fermentación de los azúcares preferidos, glucosa y sacarosa, y la fermentación de maltosa, el principal azúcar fermentable en la masa de pan. La represión de catabolitos ralentiza el cambio y posteriormente alarga el tiempo de fermentación (Gancedo 1998). Por lo tanto, los genes asociados con la represión de la glucosa y la utilización de maltosa a menudo se han dirigido estratégicamente para la modificación genética (Osinga et al., 1989; Sun et al., 2012; Lin et al., 2014, 2015b; Zhang et al., 2015a, b). Alternativamente, la utilización de maltosa se puede mejorar seleccionando mutantes en medio que contenga maltosa fermentable con análogos de glucosa no metabolizables. Tales estrategias producen cepas con deficiencias en la represión de catabolitos que podrían co-consumir glucosa y maltosa dando como resultado una levadura de masa más rápida (Randez-Gil y Sanz 1994; Rincón et al. 2001; Salema-Oom et al. 2011). Mutantes similares también podrían reducir potencialmente el tiempo de retraso en las fermentaciones de elaboración de cerveza (New et al., 2014). Las rondas consecutivas de apareamiento y selección masivos también han producido cepas comerciales con una mejor utilización de maltosa (Higgins et al. 2001).En general, la capacidad de fermentar azúcares específicos asociados al pan (a saber, maltosa, glucosa, sacarosa y fructosa) se ha alterado para mejorar la producción de CO2, o la capacidad de fermentar, de la levadura de panadería. Uno de los problemas más comunes asociados con la fermentación de la masa es el retraso considerable entre la fermentación de los azúcares preferidos, glucosa y sacarosa, y la fermentación de maltosa, el principal azúcar fermentable en la masa de pan. La represión de catabolitos ralentiza el cambio y posteriormente alarga el tiempo de fermentación (Gancedo 1998). Por lo tanto, los genes asociados con la represión de la glucosa y la utilización de maltosa a menudo se han dirigido estratégicamente para la modificación genética (Osinga et al., 1989; Sun et al., 2012; Lin et al., 2014, 2015b; Zhang et al., 2015a, b). Alternativamente, la utilización de maltosa se puede mejorar seleccionando mutantes en medio que contenga maltosa fermentable con análogos de glucosa no metabolizables. Tales estrategias producen cepas con deficiencias en la represión de catabolitos que podrían co-consumir glucosa y maltosa dando como resultado una levadura de masa más rápida (Randez-Gil y Sanz 1994; Rincón et al. 2001; Salema-Oom et al. 2011). Mutantes similares también podrían reducir potencialmente el tiempo de retraso en las fermentaciones de elaboración de cerveza (New et al., 2014). Las rondas consecutivas de apareamiento y selección masivos también han producido cepas comerciales con una mejor utilización de maltosa (Higgins et al. 2001).

La levadura se encuentra con diversos estreses severos durante la fermentación del pan, como altas concentraciones de azúcar y sal, lo que reduce su rendimiento (Aslankoohi et al. 2013 ). Se ha demostrado que las mejoras en la resistencia general al estrés de la levadura industrial producen fermentaciones de pan más rápidas. Esto generalmente se logra aumentando la producción de glicerol y otras pequeñas moléculas protectoras como la prolina y la trehalosa (Shima y Takagi 2009 ). La sobreexpresión de genes de síntesis de glicerol, como GPD1, aumenta la acumulación de glicerol y la osmotolerancia posterior (Aslankoohi et al. 2015 ). Modificación de las permeasas de prolina ( PUT4 ) o genes de biosíntesis de prolina ( PRO1) aumenta la acumulación de prolina y mejora la osmo, crio y halotolerancia (Kaino et al. 2008; Poole et al. 2009; Sasano et al. 2012). Disruption of trehalose degradation ( ). La evolución dirigida también se ha utilizado para mejorar la tolerancia al estrés en la levadura de panadería. La mutagénesis ultravioleta seguida de 200 ciclos consecutivos de congelación-descongelación produjo mutantes con mejor tolerancia a la congelación, sin efectos secundarios indeseables en otras propiedades de fermentación (Teunissen et al. 2002NTH1, ATH1) or efflux (FPS1) increases intracellular trehalose levels and improves freeze tolerance (Shima et al.1999; Izawa et al.2004; Sasano et al.2012; Sun et al.2016). Overexpression of CAF16 and ORC6, two genes that are upregulated during osmotic and cryostress, also improves overall stress tolerance of the yeast during baking (Pérez-Torrado et al.2010).

Acetaldehído y ácido acético en la industria

El acetaldehído es el intermedio central entre el piruvato y el etanol, pero también es un importante compuesto aromático. Es cuantitativamente el aldehído más abundante en la mayoría de los productos fermentados, incluido el jugo y las bebidas espirituosas de manzana (Miyake y Shibamoto 1993 ), la cerveza (Margalith 1981; Adams and Moss ). Sin embargo, también es conocido por su indeseable sabor a manzana verde o herbáceo cuando excede los niveles de umbral. Este umbral varía drásticamente entre matrices, con 10 μg / g (ppm) reportados para cerveza (Meilgaard 1982 ), 30 μg / g para sidra (Williams 1974 ) y hasta 130 μg / g para ciertos vinos (Berg et al. 1955) .1995), cider and perry (Williams 1975), wine (Liu and Pilone 2000), cheese (Engels et al.1997), yoghurt (Zourari, Accolas and Desmazeaud 1992) and ripened butter (Lindsay, Day and Sandine 1965). Production of acetaldehyde has direct influence on the final product's aroma, levels of ethanol production, as well as product stability and toxicology (Romano et al.1994). At low levels, acetaldehyde provides a pleasant, fruity aroma and is a decisive aromatic compound of many sherry-type and port wines (Zea et al.2015). Las conversiones químicas durante el envejecimiento también pueden aumentar las concentraciones generales de acetaldehído de las bebidas fermentadas con el tiempo (Vanderhaegen et al. 2003 ).

Aparte de su efecto directo sobre el sabor, se podría decir que el acetaldehído tiene incluso un papel más importante indirectamente. La molécula es extremadamente reactiva y puede reaccionar con varios otros compuestos. En los vinos tintos, por ejemplo, el acetaldehído influye en varios parámetros que no están directamente relacionados con el aroma. Puede unirse al dióxido de azufre (SO 2 ), lo que reduce drásticamente la eficacia de este agente antimicrobiano, lo que facilita el deterioro (Liu y Pilone 2000 ). El acetaldehído también puede reaccionar con los taninos, que son polifenoles naturales en las uvas, para formar puentes covalentes irreversibles, lo que resulta en una reducción de la sensación en boca seca y fruncida ('astringencia') que se asocia con estos compuestos (Mercurio y Smith 2008).). Se observa una reacción de condensación similar entre antocianinas o entre antocianinas y taninos mediada por complejos con puentes de acetaldehído, lo que da como resultado pigmentos poliméricos que influyen en el color del vino. Estos complejos altamente estables no son susceptibles al blanqueamiento por SO 2 o cambios en el pH del vino y, por lo tanto, son deseables para la estabilidad del color (Boulton 2001 ). De manera similar, se observaron interacciones entre la antocianina malvidina 3-monoglucósido y las catequinas en presencia de acetaldehído, que también influyen en el color y la estabilidad del color en el vino tinto (Rivas-Gonzalo, Bravo-Haro y Santos-Buelga 1995). El papel central del acetaldehído en estas reacciones incluso inspiró a los investigadores a experimentar con la adición exógena de acetaldehído, produciendo vinos tintos con astringencia reducida y color más estable (Sheridan y Elias 2015 ).

El ácido acético se conoce, en la industria, como acidez volátil o olor a vinagre. Si bien las especies industriales de Saccharomyces pueden producir ácido acético, la presencia de altas concentraciones de ácido acético a menudo indica la presencia de otras especies. Los niveles altos de ácido acético se asocian típicamente con el metabolismo respiratorio del etanol por las bacterias del ácido acético. Sin embargo, algunas levaduras, en particular Brettanomyces spp., Pueden producir ácido acético en condiciones aeróbicas (Crauwels et al. 2015 ). Este rasgo depende en gran medida de la cepa y de la especie (Castro-Martinez et al. 2005; Rozpędowska et al. 2011 ). Una especie, Brettanomyces bruxellensis, es tan eficiente en la producción de ácido acético que se ha propuesto como organismo candidato para la producción industrial (Freer 2002; Freer, Dien y Matsuda 2003 ).

En casos específicos, se desea la presencia de estas especies productoras de ácido para la fermentación, pero más comúnmente el ácido acético es un signo de deterioro. En el vino, se aceptan 0,2 a 0,4 g / L de ácido acético, pero por encima de 1,2 a 1,3 g / L se considera una falta. Por el contrario, concentraciones de hasta 1,5 g / L son comunes en las cervezas Lambic y, en combinación con el ácido láctico producido por bacterias, son cruciales para las características ácidas de Lambic (Witrick 2012 ).

Efectos de los parámetros ambientales sobre la producción de acetaldehído y ácido acético

Los niveles altos de acetaldehído no son deseables en un contexto industrial y se han sugerido algunos ajustes simples a los parámetros de fermentación para alterar el nivel de acetaldehído (Tabla ​(Tabla 3).3). Por ejemplo, la producción de acetaldehído en algunas cepas de vino permanece constante cuando se fermenta entre 12 ° C y 24 ° C, pero aumenta drásticamente a 30 ° C (Romano et al. 1994 ). La suplementación de SO2 también induce la producción de acetaldehído, pero se desconocen los mecanismos subyacentes (Herraiz et al. 1989; Herrero, García y Díaz 2003 ).

Tabla 3.

Efecto de los parámetros ambientales sobre la producción de acetaldehído y ácido acético.

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de acetaldehído	Referencia
La temperatura	Incrementar	Incrementar	Romano et al. ( 1994 )
Oxígeno	Incrementar	Incrementar	Branyik et al. ( 2008 ), Curiel et al. ( 2016 )
Composición media
Fuente C	No fermentable	Incrementar	Romano et al. ( 1994 )
SO 2	Incrementar	Incrementar	Jackowetz y col. ( 2011 )
		Efecto sobre la producción de ácido acético
Brettanomyces
Oxígeno	Incrementar	Incremento (efecto directo sobre la producción)	Rozpedowska et al. (2011)
Composición media
Agentes antimicrobianos (sulfitos, quitosanos,…)	Suplementacion	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Portugal et al. ( 2014 )
Ácidos débiles y ácido sórbico	Suplementacion	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Wedral et al. ( 2010 )
Baja corriente eléctrica	Aplicación de ∼200 mA	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Zuehlke et al. (2013)
Campo eléctrico pulsado	Aplicación de pulsos de ∼30 kV / cm, 1–4 μs	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Zuehlke et al. (2013)
Saccharomyces
La temperatura	Disminución	Disminución	Beltran et al. ( 2008 )
Oxígeno	Incrementar	Incrementar	Curiel et al. ( 2016 )
Composición media
Concentración de C	Incrementar	Aumento (producción de glicerol, desequilibrio redox)	Bely et al. ( 2003 )
Fuente de N	Suplementacion	Disminuir (estimula el crecimiento de levaduras, proporciona NADH)	Bely et al. ( 2003 ), Barbosa et al. 2009
Cobre	Suplementacion	Incrementar	Ferreira et al. ( 2.006 )
Lías de levadura y material insoluble	Incrementar	Variable (algunos conducen a aumentar, otros a disminuir)	Delfini y Costa ( 1993

Dado que el ácido acético tiene diferentes fuentes en las bebidas fermentadas (levadura y bacterias), existen diferentes estrategias para orientar su producción. Aquí nos centramos en el control del ácido acético derivado de la levadura de dos importantes géneros de levadura asociados con las fermentaciones industriales ​(Tabla 3). La producción de Brettanomyces se puede controlar reduciendo la disponibilidad de oxígeno (Rozpędowska et al. 2011 ), complementando la fermentación con agentes antimicrobianos (Portugal et al. 2014 ) o aplicando corrientes eléctricas (Zuehlke, Petrova y Edwards 2013 ). La producción de Saccharomyces se puede reducir promoviendo el crecimiento general. La producción de ácido acético es impulsado por la acumulación de NAD + durante la producción de glicerol (Eglinton et al. 2002) y el aumento de la biomasa (es decir, el crecimiento) puede ayudar a regenerar la reserva de NADH. La suplementación de nitrógeno o ácidos grasos insaturados puede promover el crecimiento de la levadura con una posterior reducción del ácido acético (Varela et al. 2012 ). Reducir la producción de glicerol al disminuir la concentración de azúcar también puede disminuir los niveles de ácido acético en el producto final (Bely, Rinaldi y Dubourdieu 2003 ).

Factores genéticos y producción de acetaldehído y ácido acético

Dado el papel central del acetaldehído en el metabolismo del carbono (Fig. ​(Figura 2),2), no es una tarea sencilla modular específicamente su producción. Sin embargo, la atenuación del metabolismo del etanol (Wang et al. 2013 ), el aumento de la captación de acetaldehído a través del glutatión (Chen et al. 2012 ), la oxidación de acetaldehído a ácido acético (Yao et al. 2012 ) o el aumento del flujo de piruvato hacia las mitocondrias (Agrimi et al. al., 2014; Bender, Pena y Martinou 2015; Jayakody. et al 2016 ) se ha demostrado reducir los niveles de acetaldehído. Las cepas seleccionadas por su resistencia al inhibidor de Adh2 4-metilpirazol demostraron una disminución de la expresión de ADH2 y una reducción del 82% en la producción de acetaldehído (Wanget al. 2013 ). De manera similar, la interrupción directa de ADH2 reduce el acetaldehído en un 68% (Wang et al. 2006 ).

La reducción de la acidez volátil es principalmente una preocupación en la industria del vino. La fermentación aeróbica puede provocar niveles excesivos de ácido acético. Debido a la complejidad de esta parte de la vía metabólica, la alteración directa de genes asociados puede tener efectos múltiples y en ocasiones no deseados. La eliminación de PDC1 o ALD6 puede reducir los niveles de acetato pero aumenta significativamente los niveles de acetaldehído, lo que limita su aplicabilidad (Luo et al. 2013; Curiel et al. 2016 ). La sobreexpresión se ha mencionado anteriormente de GPD1 disminuye eficazmente la producción de etanol, pero también conduce a niveles de ácido acético excesivamente altas en el vino (Cambon et al. 2006). La combinación de esta sobreexpresión con la deleción de ALD6 reduce el ácido acético pero también aumenta el acetaldehído y la acetoína. Esto se puede compensar con la sobreexpresión de BDH1, que desvía el exceso de acetaldehído y acetoína a 2,3-butanodiol, que no tiene ningún efecto sobre el sabor y el aroma en general (Fig.​(Figura 2)2) (Ehsani et al. 2009 ). Los enfoques menos directos requieren menos compensación genética. Por ejemplo, la deleción de AAF1, un regulador transcripcional de los genes ALD, reduce los niveles de ácido acético sin afectar la producción de acetaldehído (Luo et al. 2013 ). Las cepas con mutaciones en YAP1, un factor de transcripción involucrado en la tolerancia al estrés oxidativo, también demuestran niveles reducidos de ácido acético ( Yamamoto et al. 2000; Cordente et al.2013).

Funciones fisiológicas y ecológicas del CO 2, acetaldehído y ácido acético

Aunque no es un aroma distinguible para los humanos, otros organismos tienen distintas respuestas sensoriales al dióxido de carbono. En las poblaciones de levaduras, incluida S. cerevisiae, el CO 2 puede mediar en las interacciones célula-célula, induciendo el crecimiento y la gemación de las colonias vecinas (Volodyaev, Krasilnikova e Ivanovsky 2013 ). En Candida albicans, el aumento de las concentraciones de CO 2 autogenerado hace que las células experimenten cambios morfológicos y cambien a un crecimiento hifal (Hall et al. 2010 ). Curiosamente, este mecanismo se ha relacionado con la patogenicidad de C. albicans., ya que el cambio al crecimiento filamentoso es importante para la formación de biopelículas y el crecimiento invasivo en el huésped (Hall et al. 2010; Lu et al. 2013 ).

La acumulación de acetaldehído en las células de levadura produce una inhibición del crecimiento y una respuesta al estrés (Stanley et al. 1993; Aranda y Olmo 2004 ). Cuando el acetaldehído se difunde fuera de la célula, actúa como una molécula de señalización volátil. A altas densidades de células, las células de levadura coordinan su metabolismo al detectar el acetaldehído secretado, lo que resulta en oscilaciones macroscópicas colectivas y fases sincronizadas de crecimiento (Richard et al. 1996 ). Curiosamente, varios sistemas celulares, desde colonias de levaduras hasta músculos humanos e incluso tumores, demuestran este tipo de oscilaciones sincronizadas de reacciones glucolíticas (Betz y Chance 1965; Tornheim y Lowenstein 1974; Nilsson et al.1996; Richard 2003; Fru et al. 2015 ).

El ácido acético es potencialmente utilizado por Brettanomyces como una estrategia para superar a otros microbios (Rozpędowska et al. 2011 ). La estrategia de "hacer-acumular-consumir" permite que la levadura Brettanomyces acumule altos niveles de ácido acético, lo que reduce drásticamente el pH del medio ambiente. Dado que esta levadura tiene una mayor tolerancia al pH bajo que la mayoría de los microbios, puede soportar el ambiente extremo y luego consumir el ácido acético como una fuente extra de carbono.

Estos tres compuestos también juegan un papel importante en el comportamiento de los insectos. El acetaldehído es un componente central de una mezcla de compuestos que se utiliza para atraer y atrapar escarabajos plaga del género Carpophilus (Phelan y Lin 1991; Nout y Bartelt 1998 ). En varios informes, el CO 2 tuvo un efecto repulsivo sobre las moscas de la fruta (Suh et al. 2004; Turner y Ray 2009 ). Estudios recientes indican que esta repulsión depende en gran medida del contexto de comportamiento, es decir, si las moscas están caminando en la superficie o volando en el aire (Wasserman, Salomon y Frye 2013 ). En vuelo, Drosophila melanogaster se siente atraído por el CO 2, posiblemente debido a modulaciones de neurotransmisores que ocurren durante el vuelo (Orchard, Ramirez y Lange 1993 ). La hipótesis actual es que en condiciones de hacinamiento, cuando las moscas se juntan en una superficie, el CO 2 es repulsivo, pero cuando vuela y busca alimento, el CO 2 puede actuar como una señal atractiva para indicar la presencia de frutos en fermentación.

El ácido acético también es un volátil importante para mediar el comportamiento de D. melanogaster. Se informa que esta mosca de la fruta tiene una neurona olfativa altamente selectiva para la detección de ácidos, lo que generalmente está relacionado con el comportamiento observado de evitar el ácido (Ai et al. 2010 ). Sin embargo, también se sabe que D. melanogaster es atraído por el ácido acético (Hutner, Kaplan y Enzmann 1937; Knaden et al. 2012 ), lo que explica su atracción por el vinagre y el apodo de 'mosca del vinagre'. Las hembras buscan ovipositioning sitios son fuertemente atraídos por el ácido acético, mientras que las moscas no están preparados para los huevos de depósito muestran poca o ninguna atracción (Joseph et al. 2009; Gouet al. 2014 ). La especie estrechamente relacionada, D. simulans, es rechazada por el ácido acético producido microbianamente; este comportamiento se correlaciona fuertemente con el aumento de la concentración de ácido (Günther et al. 2015 ). Estos ejemplos sugieren una complejidad en la percepción y el procesamiento de la información sensorial, tanto gustativa como olfativa, para modular el comportamiento. En este ejemplo, se ha planteado la hipótesis de que la preferencia por la puesta de huevos en sustratos que contienen ácido acético depende de las entradas gustativas (las hembras probarán el ácido acético cuando estén en la superficie). Sin embargo, cuando no está en contacto directo con el medio, la información olfativa sólo conduce a la aversión de los alimentos que contiene ácido acético (Joseph et al. 2009). Junto con el etanol, el ácido acético también se ha encontrado como un volátil importante para atraer moscas como Fannia canicularis, Muscina stabulans y Philornis downsi (Diptera: Muscidae) a sustratos fermentadores como fuente de alimento (Landolt, Cha y Zack 2015; Cha et al.. 2016 ). Además, cuando el ácido acético se combina con otros compuestos de fermentación, como el fenilacetaldehído, se logra una mayor atracción de insectos (Becher et al. 2010, 2012; Cha et al. 2012 ).

METABOLITOS DE AMINOÁCIDOS: DIQUETONAS VICINALES

Bioquímica de la producción de dicetona vecina

Las dicetonas vecinales (es decir, compuestos que contienen dos enlaces dobles carbono-oxígeno adyacentes) se pueden producir durante la fermentación a través de la descarboxilación no enzimática de intermediarios en las vías anabólicas de la valina y la isoleucina (Fig. ​(Fig. 3).3). Durante la fermentación, el piruvato se puede convertir en varios compuestos de carbono como el acetolactato. El acetolactato puede entonces desviarse hacia la síntesis de valina y leucina. La ineficacia de la vía de biosíntesis de valina durante el crecimiento da como resultado una acumulación de acetolactato que luego se secreta al medio. De manera similar, durante la biosíntesis de isoleucina, se produce y también se secreta acetohidroxibutirato. Ambos compuestos no se convierten enzimáticamente en dicetonas: la descarboxilación del acetolactato forma diacetil (2,3-butanodiona) mientras que la descarboxilación del acetohidroxibutirato forma 2,3-pentanodiona. Hacia el final de la fermentación, estos compuestos pueden ser reabsorbidos por la célula y se convierten a acetoína (y, posteriormente, 2,3-butanodiol) y 3-hidroxi-2-pentanona por diversos reductasas (van Bergen et al. 2016).

Figura 3.

Producción de dicetonas vecinales. Las dicetonas vecinas se producen como subproductos durante las vías biosintéticas de isoleucina-leucina-valina (ILV). Los nombres de los genes se correlacionan con la nomenclatura de S. cerevisiae (Saccharomyces Genome Database). OYE = 'Enzima amarilla vieja'. Las líneas punteadas indican importación / exportación, las líneas continuas indican reacciones bioquímicas. Nota: la línea de puntos que va del azúcar al piruvato también incluye la glucólisis.

Dicetonas vecinales en la industria

Las dicetonas vecinales pueden proporcionar un agradable sabor a nuez, tostado y a caramelo en los alimentos y bebidas fermentados, sobre todo en la cerveza, el vino y los productos lácteos (Molimard y Spinnler 1996; Bartowsky y Henschke 2004; Krogerus y Gibson 2013a ). Sin embargo, se consideran sabores desagradables cuando están presentes en altas concentraciones, lo que cambia su percepción sensorial a "mantecoso" o "rancio". Especialmente en la elaboración de cerveza, la producción de dicetona vecina es un desafío continuo. El diacetilo rara vez se percibe positivamente en la cerveza, excepto en algunos estilos específicos (por ejemplo, sour ales, Bohemian Pilsner y algunas cervezas inglesas).

En general, el diacetilo se centra más en la fermentación de cerveza industrial que la 2,3-pentanodiona por dos razones. Primero, tiene un umbral sensorial significativamente más bajo (0.1 μg / g versus 1.0 μg / g) que lo hace más detectable en el producto final. En segundo lugar, la conexión directa entre diacetilo y piruvato tiene implicaciones en la gestión de los niveles de producción de etanol. En el vino, el diacetilo se considera un problema menor y las concentraciones bajas (1-4 μg / g) contribuyen positivamente a las deseables notas mantecosas o dulces. Además, las concentraciones excesivamente altas son raras, pero más bien indican deterioro bacteriano u otras irregularidades durante la fermentación maloláctica (Bartowsky y Henschke 2004 ). Además, el diacetilo está enmascarado en parte por la presencia de SO 2en el vino, lo que da como resultado un marcado aumento en los niveles de umbral (Bartowsky y Henschke 2004 ).

Parámetros ambientales y producción de dicetona vecina

Debido a las condiciones altamente reductoras que existen al final de las fermentaciones alcohólicas, la concentración de diacetilo suele estar por debajo (o cerca de) su umbral de detección sensorial en la cerveza fresca (Haukeli y Lie 1972). La reducción de diacetilo elimina eficazmente los sabores no deseados, ya que la acetoína y el 2,3-butanodiol no contribuyen al perfil de aroma. Por lo tanto, algunas cervezas se someten a una fase de maduración de 2 a 3 semanas después de la fermentación para permitir que cualquier acetolactato residual se descarboxile y posteriormente sea reducido por la levadura por debajo de su límite de detección. Esta fase de maduración requiere capacidades de almacenamiento y limita la producción de cerveza de una cervecería y la viabilidad económica. Por lo tanto, se han realizado esfuerzos considerables para encontrar formas alternativas de reducir la formación de diacetilo natural o acelerar la reducción de diacetilo mediante la modificación de varios parámetros del proceso (Tabla​(Tabla44).

Cuadro 4.

Efecto de los parámetros ambientales sobre la producción de dicetona vecina.

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de dicetona vecina	Referencia
La temperatura	Incrementar	Disminución durante la fermentación o maduración (mayor densidad celular, más conversión de acetolactato a diacetilo)	Bamforth y Kanauchi ( 2004 )
pH	Disminución	Aumento (mayor eficiencia enzimática)	Bamforth y Kanauchi ( 2004 )
Tiempo de fermentación	Incrementar	Disminución (más conversión de acetolactato a diacetilo y reducción de diacetilo)	Bamforth y Kanauchi ( 2004 )
Oxígeno	Incrementar	Disminuir (mayor densidad celular)	Portno ( 1966 )
Composición media
Suplementación con valina	Incrementar	Disminución (menor producción de acetolactato, ver figura ​Figura 22)	Krogerus y Gibson ( 2013b )
Concentración de azúcar	Incrementar	Disminución	Saerens et al. ( 2008b )
Enzima (α-acetolactato descarboxilasa)	Suplementacion	Disminuir (conversión de acetolactato a acetoína)	Godtfredsen y Ottesen ( 1982 )

La conexión con el metabolismo de los aminoácidos afecta directamente la síntesis de estos dos compuestos; si el nitrógeno es bajo y la célula necesita sintetizar sus aminoácidos, la producción de estos subproductos también aumentará (Krogerus y Gibson 2013a ). El simple hecho de complementar los medios de fermentación con valina exógena puede disminuir drásticamente la producción de diacetilo (Krogerus y Gibson 2013b ). Dado que la conversión de acetolactato en diacetilo no es enzimática, el calentamiento después de la fermentación aumenta la tasa de conversión del exceso de acetolactato, que posteriormente puede reducirse (Kobayashi et al. 2005 ). El uso de una configuración de fermentación continua minimiza el crecimiento de levadura y, por lo tanto, la biosíntesis de valina y reduce la formación de diacetilo (Verbelen et al.2006).

Factores genéticos y producción de dicetona vecina

Podría decirse que una de las estrategias más prometedoras y más baratas para reducir las dicetonas vecinales es la modificación del metabolismo de las levaduras. Más comúnmente, esto se hace aumentando el flujo metabólico de acetolactato a valina o promoviendo la conversión de acetolactato en acetoína. La mutación de ILV2 (acetolactato sintasa) reduce la formación de diacetilo en un 64% (Wang et al. 2008 ). De manera similar, el aumento de la expresión de ILV5 (acetohidroxiácido reductosiomerasa), el paso limitante de la velocidad en la síntesis de valina, reduce la formación de diacetilo entre un 50% y un 60% (Mithieux y Weiss 1995; Kusunoki y Ogata 2012). La expresión heteróloga de un gen bacteriano de acetolactato descarboxilasa (ALDC) cataliza la descarboxilación no oxidativa de acetolactato a acetoína y evita la producción de diacetilo (Kronlof y Linko 1992 ).

Funciones fisiológicas y ecológicas de las dicetonas vecinales

Como se describió, la producción de dicetonas vecinales se realiza extracelularmente después de la secreción de acetolactato y acetohidroxibutrato acumulados. Se desconoce el papel biológico de este fenómeno, pero se ha sugerido la protección contra el estrés carbonílico y el daño celular subsiguiente (van Bergen et al. 2016 ). Además, la reducción de dicetonas es fisiológicamente favorable para la levadura, ya que los productos finales resultantes son menos tóxicos y las reacciones reponen los conjuntos de NAD + y NADP + (De Revel y Bertrand 1994 ).

El diacetilo tiene un papel de "enmascaramiento" en entornos ecológicos más que un papel directo como molécula de señalización. Drosophila melanogaster tiene neuronas de alta especificidad para detectar diacetilo y CO 2 (de Bruyne, Foster y Carlson 2001 ). Como se discutió anteriormente, el CO 2 puede provocar un comportamiento de evitación en las moscas de la fruta, lo que parece algo contrario a la intuición, ya que el CO 2 es una señal de fermentación de la fruta, una fuente de alimento adecuada y un sitio de oviposición. El diacetilo enmascara la señal de evitación bloqueando el receptor, lo que resulta en atracción hacia la fuente de fermentación (Turner y Ray 2009; Turner et al. 2011). Se observa una interacción inversa en varias especies de mosquitos, donde los mosquitos son atraídos por el CO 2, que luego es bloqueado por la presencia de diacetilo (Turner et al. 2011 ).

METABOLITOS DE AMINOÁCIDOS: ALCOHOLES MÁS ALTOS

Quizás la vía bioquímica mejor caracterizada en la producción de aroma de levadura es la vía Ehrlich. Es probable que esto se deba a los compuestos muy deseables y reconocibles producidos por esta vía: los alcoholes superiores (fusel) y, posteriormente, los ésteres de acetato. Felix Ehrlich postuló por primera vez la conexión entre el metabolismo de los aminoácidos y la formación superior de alcohol en 1907 basándose en su similitud estructural ​(Figura 4). Esto condujo a un experimento clásico y simple de variar la concentración de aminoácidos específicos en el medio de fermentación y observar cambios en la producción de los correspondientes alcoholes fusel (Ehrlich 1907 ). Durante el próximo siglo, los detalles de este proceso bioquímico se han descubierto en gran medida, lo que ha conducido a importantes mejoras en la industria de la fermentación.

Figura 4.

La vía de Ehrlich. Hay varias rutas que pueden dirigir los compuestos de carbono a la producción de aminoácidos y, posteriormente, a los alcoholes superiores. Este esquema describe las conexiones más directas entre los aminoácidos y los respectivos alcoholes superiores a través de la vía de Ehrlich de tres pasos (reacciones generales representadas en la parte superior). Las líneas punteadas indican varios pasos. Nota: el paso de reducción puede ser realizado por más de 10 enzimas diferentes que varían en localización, regulación y especificidad de sustrato; AdhX = alcohol deshidrogenasa (Adh1, Adh2, Adh3, Adh4, Adh6, Adh7); AadX = aril alcohol deshidrogenasa (Aad3, Aad4, Aad6, Aad10, Aad14, Aad15, Aad16).

Bioquímica de la producción superior de alcohol.

La vía de Ehrlich es un proceso de tres pasos que modifica los aminoácidos asimilados, la principal fuente de nitrógeno en muchos procesos de fermentación. En general, los aminoácidos se desaminan, descarboxilan y finalmente se reducen a sus respectivos derivados alcohólicos ​(Figura 4). Al modificar secuencialmente los aminoácidos, las células de levadura pueden recolectar y utilizar el nitrógeno esencial según sea necesario y, a su vez, producir una variedad de compuestos aromáticos fragantes y distintos (Hazelwood et al. 2008; Pires et al. 2014 ). Dadas las similitudes químicas de los intermediarios con el piruvato, el acetaldehído y el etanol, muchas de las mismas enzimas involucradas en la producción de los metabolitos primarios de fermentación también están involucradas en esta vía.

Transaminación

Después de la absorción del medio, los aminoácidos se convierten en sus respectivos α-cetoácidos mediante una transaminasa capaz de transferir grupos amina entre aminoácidos. En Saccharomyces cerevisiae, existen seis enzimas capaces de este tipo de reacción: Bat1, Bat2, Aat1, Aat2, Aro8 y Aro9 (SGD, Cherry et al. 2012 ). Aat1 y Aat2 no intervienen en una mayor producción de alcohol; estas enzimas actúan específicamente sobre el aspartato como parte de la lanzadera malato-aspartato para mover electrones desde el citosol a las mitocondrias para la producción de energía respiratoria (Cronin et al. 1991; Morin, Subramanian y Gilmore 1992). Las otras cuatro enzimas se han relacionado directamente con una síntesis superior de alcohol pero, como se ve con las ADH discutidas anteriormente, cada una contribuye de manera diferente a la vía de Ehrlich. Bat1 y Bat2 participan principalmente en la transaminación de los aminoácidos de cadena ramificada, mientras que Aro8 y Aro9 son transaminasas de aminoácidos aromáticos que actúan sobre fenilalanina y triptófano, respectivamente (Kispal et al. 1996; Iraqui et al. 1998 ).

Descarboxilación

El segundo paso de la vía de Ehrlich es la descarboxilación irreversible del α-cetoácido a un aldehído. Las mismas tres PDC utilizadas en la producción de acetaldehído (Pdc1, Pdc5 y Pdc6) han estado implicadas en la producción de aldehídos fusel. Además, Aro10 es capaz de esta reacción y es el principal responsable de descarboxilar el 2-fenilpiruvato a 2-fenilacetaldehído (Vuralhan et al. 2003 ). Aro10 también es un candidato probable para algunas variaciones en la producción de alcohol más alta entre especies. Saccharomyces kudriavzevii produce más alcoholes superiores que S. uvarum o S. cerevisiae (Stribny et al. 2016 ). Sc Aro10 prefiere fenilpiruvato peroSk Aro10 tiene una preferencia de sustrato más amplia, actuando casi por igual sobre fenilpiruvato, cetoisocoaproato, cetoisovalerato, cetometilvalerato e incluso ceto-γ-metiltiobutirato (Stribny et al. 2016 ). Curiosamente, el híbrido entre especies, S. pastorianus, alberga tres copias del gen ARO10 de S. cerevisiae y una copia de S. eubayanus. Si bien ambas isoenzimas prefieren el fenilpiruvato como sustrato, Seu Aro10 tiene una actividad mucho mayor hacia el cetoisovalerato (Bolat et al. 2013 ). La variación del número de copias y las ligeras discrepancias en la preferencia del sustrato añaden un nivel de complejidad aromática a las levaduras de elaboración de cerveza híbridas.

Reducción

En este punto, los aldehídos fusel pueden sufrir una oxidación o una reducción. Los diversos ADH y AAD catalizan el paso de reducción y completan la vía de Ehrlich. Cualquiera de las enzimas ADH puede catalizar este último paso, pero las investigaciones indican que Adh1 y Adh2 participan principalmente en el metabolismo del etanol (descrito anteriormente). Si los aldehídos fusel experimentan una reacción de oxidación por un ALD, se convierten en sus respectivos ácidos fusel.

Alcoholes superiores en la industria

Los alcoholes superiores pueden impartir un efecto muy deseado sobre el sabor del producto a pesar de su umbral sensorial más alto, que puede diferir en varios órdenes de magnitud en comparación con sus correspondientes ésteres de acetato. Los principales alcoholes fusel que se encuentran en las bebidas alcohólicas son 1-propanol (aroma alcohólico), 1-butanol (alcohólico), isobutanol (alcohólico), 2-feniletanol (rosas, florido) y alcohol isoamílico (plátano, afrutado).

La fragancia similar a la rosa del 2-feniletanol lo ha convertido en un compuesto deseable para su uso en muchos perfumes, cosméticos y bebidas (Etschmann et al. 2002 ). Actualmente, la mayor parte de su producción comercial se realiza de forma sintética, pero este proceso requiere el uso de precursores cancerígenos, como el benceno y el estireno, y produce diversos subproductos difíciles de eliminar. Es posible extraer 2-feniletanol de los aceites esenciales de las plantas, pero este proceso es excesivamente caro debido a los bajos rendimientos (Etschmann et al. 2002 ). Por lo tanto, los investigadores han recurrido a la producción microbiana de este compuesto (Carlquist et al. 2015 ). Saccharomyces cerevisiae genéticamente modificado o mutagenizadoSe han utilizado cepas para convertir fenilalanina en 2-feniletanol, típicamente mejorando la vía de Ehrlich (Kim, Cho y Hahn 2014 ). Las levaduras no convencionales también se han explorado como cepas de producción, incluida Kluyveromyces marxianus, que naturalmente produce más 2-feniletanol que S. cerevisiae (Ivanov et al. 2013 ). Además, K. marxianus crece rápidamente y es termotolerante, lo que lo convierte en un candidato interesante para la producción comercial (Etschmann, Sell y Schrader 2003; Gao y Daugulis 2009; Morrissey et al. 2015 ).

Los ácidos fusel asociados también son de interés industrial. La producción de estos compuestos se puede percibir positiva o negativamente según el contexto. En la salsa de soja, las cepas formadoras de flores de Zygosacharomyces rouxii pueden producir ácido 2-metilpropanoico (ácido isobutírico) y ácido 3-metilbutanoico (ácido isobutírico) (alcoholes correspondientes isobutanol y alcohol isoamílico), compuestos asociados con aromas desagradables y estropeados. En algunos casos, se han empleado enfoques de ingeniería metabólica para aumentar realmente la producción de estos ácidos. Los ácidos grasos de cadena ramificada corta como el ácido 2-metilbutanoico, el ácido isobutírico y el ácido isovalérico son compuestos valiosos en las industrias alimentaria y farmacéutica. Los ácidos y sus derivados se pueden utilizar como fragancias y los aromas (Yu et al. 2016).

Parámetros ambientales y mayor producción de alcohol

El proceso de tres pasos descrito anteriormente se sitúa en una compleja red de metabolismo de aminoácidos: existen múltiples caminos hacia cada uno de los principales alcoholes que requieren una regulación y un equilibrio significativos durante el proceso de fermentación. Además, los niveles de cada compuesto se ven dramáticamente afectados por la composición del medio, especialmente la fuente de carbono y las fuentes de nitrógeno ​(Tabla 5). Dado que los alcoholes superiores se producen principalmente durante el crecimiento activo, los factores que influyen positivamente en el crecimiento de la levadura promueven simultáneamente una mayor síntesis de alcohol (Dekoninck 2012 ). Si hay un excedente de aminoácidos exógenos, como lo muestran Ehrlich y otros, la producción de estos alcoholes aumenta (Ehrlich 1907; He et al. 2014 ). Si los aminoácidos escasean, las vías inevitablemente favorecerán las vías anabólicas. Este entendimiento ha sido adoptado por la industria como una forma poderosa de dirigir una mayor producción de alcohol (Etschmann et al. 2002; Vidal et al. 2013; Lei et al. 2013a ).

Cuadro 5.

Efecto de los parámetros ambientales sobre una mayor producción de alcohol.

Parámetro	Condición	Efecto sobre una mayor producción de alcohol	Referencia
La temperatura	Incrementar	Incrementar	Landaud y col. ( 2001 )
Oxígeno	Incrementar	Incrementar	Valero et al. (2002)
Composición media
Fuente C	Maltosa	Disminución (en comparación con sacarosa, fructosa, glucosa)	Younis y Stewart ( 1998 )
Concentración de azúcar	Incrementar	Disminuir (no siempre)	Younis y Stewart ( 1999 )
Fuente de N (total)	Incrementar	Disminución (corregulación de los genes LEU y BAT )	Yoshimoto et al. (2002)
NH 4	Suplementacion	Disminución	Vidal et al. ( 2013 )
Aminoácidos	Suplementacion	Aumento del alcohol superior respectivo (ver Fig. ​Fig. 33)	Hernandez-Orte et al. (2005)
Vitaminas	Suplementacion	Incrementar	Etschmann y col. ( 2004 )
Compuestos de Maillard	Incrementar	Incrementar	Dack y col. ( 2017 )

Factores genéticos y mayor producción de alcohol

Las cepas de levadura modificadas genéticamente para una mayor producción de alcohol se utilizan tanto para aumentar las concentraciones de los propios alcoholes como de sus respectivos ésteres. La sobreexpresión de ADH6 puede aumentar la producción de isobutanol (Kondo et al. 2012 ), mientras que la sobreexpresión de ADH1 puede aumentar los niveles de 2-feniletanol (Shen et al. 2016 ). Nuestro conocimiento de las vías biosintéticas y de Ehrlich de ILV permite una ingeniería metabólica compleja de varios pasos para aumentar los alcoholes superiores específicos. Por ejemplo, la sobreexpresión de ILV2, ILV3 e ILV5 aumenta el flujo hacia la producción de isoleucina (Fig.​(Fig. 3).3). Si esto se combina con la eliminación de BAT1 (transaminasa) y ALD6 (la aldehído deshidrogenasa) más la sobreexpresión de ARO10 y ADH2 (ambas alcohol deshidrogenasas), los derivados de α-cetoácido y aldehído de la isoleucina son empujados hacia la producción del alcohol superior (Fig. ​(Figura 4)4) (Park, Kim y Hahn 2014 ). Por el contrario, la deleción de la alcohol deshidrogenasa ADH con sobreexpresión de BAT1, ALD2 y ALD5 aumenta la producción de los ácidos fusel desviando el flujo en el último paso de Ehrlich hacia la oxidación. Estos ácidos también son intermedios para la producción de productos de valor agregado en la industria química (Yu et al. 2016 ).

Debido a la complejidad y naturaleza intrincada de estas vías, la mutación simple no siempre tiene el efecto deseado. Por ejemplo, algunos estudios muestran que la supresión de ARO8 (una de las transferasas aminoácidos aromáticos) aumenta el catabolismo de la fenilalanina a su mayor alcohol 2-feniletanol (Romagnoli et al. 2015; Shen et al. 2016 ), mientras que otros han demostrado que la sobreexpresión de la El mismo gen también aumenta la producción de alcoholes superiores (Yin et al. 2015; Wang et al. 2016b ). Además, la supresión de ARO9 no tiene ningún efecto aparente (Shen et al. 2016) pero su sobreexpresión provoca un aumento en la producción de alcoholes superiores (Kim, Cho y Hahn 2014 ). Estos resultados contradictorios podrían deberse a una multitud de factores, incluidas las diferencias en el fondo de la cepa o las variaciones en los medios utilizados para las fermentaciones. Independientemente, esto apunta a una relación significativamente más complicada entre las aminotransferasas que puede ayudar a contribuir a la diversidad de una mayor producción de alcohol en diferentes cepas.

Como resulta evidente a partir de los ejemplos anteriores, se necesita una ingeniería metabólica sofisticada para obtener cepas altamente productivas para alcoholes superiores. Varios equipos de investigación se centran en los isómeros del butanol, ya que estos compuestos se pueden utilizar como combustibles alternativos. Recientemente se ha publicado en otra parte una descripción general exhaustiva de las estrategias de ingeniería metabólica para la producción de isómeros de butanol (Generoso et al. 2015 ). Pero, a pesar de los grandes esfuerzos para mejorar el rendimiento de producción de isómeros de butanol (y alcoholes superiores en general) en S. cerevisiae, la eficiencia que se puede lograr mediante ingeniería metabólica es aún significativamente menor en comparación con otros huéspedes, como Escherichia coli. Comparación del metabolismo central de modificados metabólicamenteE. coli y S. cerevisiae revelaron que la flexibilidad de este metabolismo es un factor importante en la producción eficiente de butanoles y propanoles (Matsuda et al. 2011 ).

Funciones fisiológicas y ecológicas de los alcoholes superiores

Dada la variación significativa en la producción superior de alcohol de diferentes levaduras, tal vez no sea sorprendente que los insectos hayan desarrollado la capacidad de utilizar estos compuestos como firmas químicas. Muchos receptores olfativos de insectos están específicamente en sintonía con la detección de alcoholes superiores y muchos de estos compuestos pueden provocar respuestas antenales y de comportamiento en insectos (Hallem y Carlson 2004; Saerens, Duong y Nevoigt 2010; Knaden et al. 2012; Witzgall et al. 2012) ). Se ha demostrado en varias ocasiones que los cultivos del hongo Aureobasidium pullulans, similar a la levadura, pueden atraer a una variedad de insectos, incluidos los hoverflies (Diptera: Syrphidae) (Davis y Landolt2013 ) y avispas sociales ( Vespula spp. (Hymenoptera: Vespidae) (Davis, Boundy-Mills y Landolt 2012 ). En ambos casos, una mezcla sintética de alcoholes superiores, a saber, 2-metil-1-butanol, alcohol isoamílico y 2- feniletanol, demostró ser incluso más atractivo para los insectos que el cultivo de levadura. Se sabe que las avispas actúan como vectores de A. pullulans, lo que sugiere una fuerte interacción entre las avispas y las especies de levadura (Davis, Boundy-Mills y Landolt 2012 ) .

Las mezclas de compuestos para imitar las levaduras en fermentación se están implementando comúnmente para combatir las plagas agrícolas. Muchas de las mezclas contienen alcoholes superiores, ya que tienden a ayudar a provocar respuestas y atracción antenas. El escarabajo Carpophilus humeralis infesta y daña los cultivos de maíz, y las mezclas con mayor contenido de alcohol están diseñadas para imitar el maíz fermentado de S. cerevisiae y atraerlos (Nout y Bartelt 1998 ). El escarabajo relacionado, C. hemipterus, se siente atraído de manera similar por los alcoholes superiores producidos por S. cerevisiae, a saber, 2-pentanol, alcohol isoamílico, isobutanol y butanol (Phelan y Lin 1991 ). El gorgojo Araecerus fasciculatus(Coleoptera: Anthribide), una plaga del grano de café, se encontró recientemente atraída por el 2-fentiletanol, lo que implica que el compuesto podría servir como un atractivo potencial (Yang et al. 2016 ).

Los alcoholes superiores también pueden servir como señales de directorio para insectos. Las fermentaciones de S. cerevisiae o una mezcla sintética de cinco compuestos de fermentación, incluidos etanol, alcohol isoamílico y 2-feniletanol, son suficientes para atraer a D. melanogaster (Becher et al. 2012 ). Entre otros compuestos, los alcoholes superiores producidos por Metschnikowia, incluidos el isoprenol, el 2-feniletanol y el citronelol, pueden provocar respuestas antenales en la polilla de la manzana Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) (Witzgall et al. 2012.). Las polillas utilizan los aromas emitidos para orientarse hacia sitios de oviposición adecuados, como manzanas infestadas de levadura que proporcionan una fuente de alimento para las larvas y protección contra infestaciones fúngicas dañinas.

Algunos alcoholes superiores tienen propiedades antifúngicas. El alcohol isoamílico producido por Candida maltosa inhibe la germinación de hongos filamentosos (Ando et al. 2012 ). Pichia anomala produce 2-feniletanol potencialmente como agente de control biológico contra Aspergillus flavus; el compuesto inhibe la germinación de las esporas y la producción de micotoxinas cancerígenas que pueden contaminar los cultivos en los que crece P. anomala (Hua et al. 2014 ). Kloeckera apiculata igualmente produce 2-feniletanol a inhiben el crecimiento de varios Penicillium moldes (Liu et al. 2014). Otros estudios también han demostrado efectos anti-fúngicas de volátiles de levadura de diversas especies (varios Candida especies, S. cerevisiae, A. pullulans, Metschnikowia pulcherrima ), pero los compuestos específicos efectoras aún no han sido identificados (Fiori et al. 2014; Parafati et al. 2015; Lemos junior et al. 2016 ).

Varios alcoholes superiores como 2-feniletanol, triptofol, tirosol y farnesol pueden actuar como moléculas sensibles al quórum en levaduras dimórficas, incluidas S. cerevisiae, Debaryomyces hansenii y Candida albicans. La secreción de los alcoholes regula el cambio entre las formas de levaduras unicelulares y las formas filamentosas (Chen et al., 2004; Chen y Fink 2006; Gori et al. 2011). Además, se ha especulado que estas moléculas sensibles al quórum pueden desempeñar un papel en el nivel de la población e influir en el establecimiento de comunidades microbianas en fermentaciones (semi) espontáneas, como vino, cervezas lambic y / o queso, pero hay evidencia de tal aún faltan interacciones (Ciani y Comitini 2015 ).

METABOLITOS DE AMINOÁCIDOS: ÉSTERES

Bioquímica de la producción de ésteres

Los ésteres se forman por una reacción de condensación entre acetil / acil-CoA y un alcohol (Fig. ​(Figura 5).5). El uso de acetil-CoA o acil-CoA divide los ésteres en dos categorías diferentes, ésteres de acetato y ésteres etílicos de ácidos grasos, respectivamente. El tamaño pequeño y la naturaleza lipofílica de los ésteres de acetato les permiten difundirse fácilmente desde el citoplasma hacia el medio extracelular, mientras que las colas de hidrocarburos más largas de los ésteres etílicos de ácidos grasos reducen su capacidad para difundirse a través de la membrana. Por lo tanto, los ésteres de acetato ejercen una influencia significativamente mayor sobre el sabor y la fragancia que sus homólogos de ácidos grasos.

Figura 5.

Síntesis de ésteres en levaduras. Izquierda: esquema general de ambos tipos de producción de ésteres. Los ésteres son el resultado de reacciones de condensación entre un alcohol y una acetil / acil-CoA. ( A ) Los ésteres de acetato se producen a través de las acciones de Atf1 y Atf2. ( B ) Los ésteres de ácidos grasos son producidos por Eeb1 y Eht1. Derecha: ejemplos de algunos de los ésteres más comunes discutidos en esta revisión. Los descriptores generales de aroma se enumeran en cursiva.

La síntesis de ésteres se lleva a cabo mediante alcohol-O-acetil (o acil) -transferasas (AATasas). En Saccharomyces cerevisiae, hay cuatro enzimas conocidas: Atf1 y Atf2 son responsables de la mayor parte de la producción de ésteres de acetato y Eeb1 y Eht1 sintetizan los ésteres etílicos de ácidos grasos (SGD, Cherry et al. 2012 ). Existe evidencia definitiva de que existen enzimas adicionales de ambos tipos en S. cerevisiae. La doble deleción de ATF1 y ATF2 da como resultado una pérdida completa de la producción de acetato de isoamilo, pero solo una reducción del 50% en acetato de etilo (Verstrepen et al. 2003c ). Del mismo modo, una doble deleción de EEB1 y EHT1no elimina los ésteres etílicos de ácidos grasos (Saerens et al. 2006 ).

Recientemente, una enzima formadora de etilo-acetato de tercera se ha descrito (Kruis et al. 2017 ). La etanol acetiltransferasa 1 (Eat1) se identificó en Wickerhamomyces anomalus y define una nueva familia de enzimas que es distinta de las AATasas canónicas. Eat1 es en realidad una hidrolasa que puede realizar reacciones de tioesterasa y esterasa además de la formación de acetato de etilo. Los homólogos se encuentran en varias levaduras productoras de acetato de etilo. Aunque todavía no se ha intentado una triple deleción, la deleción del homólogo Eat1 de S. cerevisiae, YGR015C, da como resultado una reducción del 50% en la producción de acetato de etilo, que complementa la producción de Atf1 y Atf2.

Las actividades enzimáticas de estas enzimas pueden diferir significativamente, incluso más entre diferentes especies y cepas, lo que se suma a la variación del producto de fermentación final. Por ejemplo, Atf1 tiene la misma especificidad de sustrato para el alcohol isoamílico y el 2-feniletanol, mientras que Atf2 prefiere el alcohol isoamílico (Stribny et al. 2016 ). Sin embargo, tanto Atf1 como Atf2 de S. kudriavzevii o S. uvarum, tienen mayor preferencia por el 2-feniletanol en comparación con los homólogos de S. cerevisiae. Esto se refleja directamente en las condiciones de fermentación, donde las cepas que albergan las enzimas S. kudriavzevii y S. uvarum producen mucho más acetato de 2-feniletilo.

Ésteres en la industria

Los ésteres son generalmente aceptados como algunos de los contribuyentes más importantes al sabor y aroma de las bebidas alcohólicas, impartiendo notas afrutadas y florales al producto (Nordström 1966; Verstrepen et al. 2003a ). Durante las fermentaciones industriales, las levaduras producen ésteres en concentraciones muy bajas, a menudo solo unas pocas partes por mil millones (ppb) (Lambrechts y Pretorius 2000 ). Por cierto, estas concentraciones naturales rondan el umbral de sabor para los humanos y, en consecuencia, pequeños cambios en la producción de ésteres pueden alterar significativamente la percepción del producto. Existe un efecto sinérgico en la percepción de muchos ésteres, donde una mezcla de compuestos resaltará o enmascarará la presencia de otros (Nordström 1964a; Suomalainen1971 ). Sin embargo, un exceso de ésteres a menudo da como resultado un producto desagradable, lo que destaca la importancia del equilibrio en la producción de compuestos aromáticos (Liu, Holland y Crow 2004 ).

La importancia general y la complejidad de la producción de ésteres han llevado a una considerable investigación industrial para optimizar la producción. Curiosamente, estos compuestos afectan la calidad de prácticamente todas las fermentaciones de alimentos que involucran levaduras, desde bebidas fermentadas (Lilly, Lambrechts y Pretorius 2000; Verstrepen et al. 2003a ), hasta pan (Birch et al. 2013; Aslankoohi et al. 2016 )., al chocolate (Meersman et al. 2016). Además, la producción biotecnológica de altas concentraciones de ésteres, especialmente acetato de etilo, se ha estudiado durante varios años. El acetato de etilo es un disolvente respetuoso con el medio ambiente con muchas aplicaciones industriales, pero su producción implica procesos petroquímicos que consumen mucha energía. Se han explorado varias levaduras no convencionales, más específicamente W. anomala, Candida utilis y especialmente Kluyveromyces marxianus, todas especies con una producción inherentemente alta de acetato de etilo (Löser, Urit y Bley 2014 ).

Parámetros ambientales y producción de ésteres

Existe una multitud de parámetros que pueden influir en la producción de ésteres en la levadura, lo que permite una modulación significativa del perfil de ésteres de los alimentos o bebidas sin manipulación genética (Tabla ​(Tabla 6).6). Sin embargo, dada la complejidad de la regulación de la disponibilidad de enzimas y sustratos, el resultado exacto de modificar un parámetro específico sigue siendo difícil de predecir. En general, la producción de acetato y éster etílico a menudo se ve afectada de la misma manera por los mismos parámetros (Saerens et al. 2008a ).

Cuadro 6.

Efecto de los parámetros ambientales sobre la producción de ésteres.

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de ésteres	Referencia
La temperatura	Incrementar	Incrementar (no siempre)	Molina et al. ( 2007 ), Saerens et al. ( 2008a )
Oxígeno	Incrementar	Disminución (disminución de la expresión de genes de síntesis de ésteres)	Fujii y col. ( 1997 ), Anderson y Kirsop ( 1974 )
Composición media
Ácidos grasos insaturados	Incrementar	Disminución (disminución de la expresión de genes de síntesis de ésteres)	Fujii y col. 1997 , Anderson y Kirsop ( 1974 )
Nitrógeno amino libre (FAN)	Incrementar	Aumento (disponibilidad de precursores y mayor expresión de genes de síntesis de ésteres)	Saerens et al. ( 2008a ), Lei et al. ( 2013ba )
Concentración de azúcar	Incrementar	Aumento (aumento de la expresión de genes de síntesis de ésteres)	Saerens et al. ( 2008b )
Fuente C	Glucosa, fructosa, sacarosa	Aumento (en comparación con la maltosa)	Verstrepen et al. ( 2003b ), Piddocke et al. ( 2009 )
Compuestos de Maillard	Incrementar	Disminución	Dack y col. ( 2017 )
Presion hidrostatica	Incrementar	Disminución (aumento de CO 2 disuelto )	Landaud et al. (2001), Meilgaard (2001)

La concentración y composición de las fuentes de carbono fermentables, así como la relación carbono-nitrógeno tienen efectos dramáticos en la producción de ésteres (Tabla ​(Tabla6)6) (Piddocke et al. 2009; Dekoninck et al. 2012 ). La conexión directa con alcoholes superiores y sus precursores de aminoácidos hace que la producción de ésteres dependa en gran medida de la fuente de nitrógeno. La concentración de nitrógeno amino libre (FAN), incluidos los aminoácidos y péptidos pequeños, se correlaciona positivamente con la producción de éster de acetato (Procopio et al. 2013; Lei et al. 2013a, b ). El aumento de nitrógeno también puede aumentar la expresión de ATF1 y BAT1 y posteriormente alterar los niveles de éster (Saerens, Thevelein y Delvaux 2008 ).

En general, las temperaturas más altas resultan en una mayor producción de alcohol y la producción de éster posterior de etilo (Landaud, Latrille y Corrieu 2001 ), aunque este efecto puede variar en las diferencias en la matriz de la fermentación, los antecedentes genéticos y los ésteres de interés (dado Molina et al. 2007; Abedul et al. 2013 ). Además, la expresión de ATF1 y ATF2 se correlaciona positivamente con la temperatura y daría lugar a aumentos en la producción de ésteres de acetato (Saerens et al. 2008b). Sin embargo, la naturaleza volátil de los ésteres de acetato conduciría a una disminución general de la concentración a temperaturas excesivamente altas. Este es el caso de la producción de chocolate; Durante el proceso de post-fermentación, la masa de chocolate se somete a una mezcla de una hora a temperaturas tan altas como 75 ° C (Meersman et al. 2016 ). Este paso de producción da como resultado la pérdida de muchos compuestos aromáticos derivados de la levadura, incluidos los ésteres de acetato. Sin embargo, los ésteres de ácidos grasos, que se disuelven más fácilmente en la fracción grasa del chocolate, se retienen en gran medida.

El oxígeno disuelto y los ácidos grasos insaturados son reguladores negativos de la expresión de ATF1 y, en consecuencia, de la síntesis de ésteres (Dufour, Malcorps y Silcock 2003 ). Curiosamente, se ha demostrado que ambos compuestos actúan sobre la misma parte del promotor ATF1, es decir, el elemento de respuesta de bajo oxígeno (Jiang et al. 2001). Por lo tanto, la oxigenación del medio de fermentación es una herramienta poderosa y sencilla para modular la producción de ésteres. Sin embargo, no siempre es factible aumentar o disminuir el contenido de oxígeno del medio, ya que puede tener efectos secundarios indeseables (por ejemplo, crecimiento irregular de levadura, estabilidad del sabor deteriorada o mayor riesgo de contaminación). Agregar ácidos grasos insaturados puede ser una alternativa interesante sin los efectos no deseados (Moonjai et al. 2002 ).

Las modificaciones en el recipiente de fermentación pueden alterar el microambiente de las células de levadura y afectar los cambios fisiológicos. Un cambio de fermentadores pequeños a recipientes cilíndricos altos y cilíndricos en las grandes cervecerías resultó en grandes disminuciones en la producción de ésteres (Meilgaard 2001 ). Esto se explica por la mayor concentración de dióxido de carbono disuelto que inhibe las reacciones de descarboxilación en general, lo que resulta en niveles más bajos de sustrato para la producción de ésteres (Landaud, Latrille y Corrieu 2001 ).

Factores genéticos y producción de ésteres

Dado que los ésteres de acetato son cuantitativamente el grupo más abundante de ésteres en las fermentaciones industriales y se ha demostrado que tienen un gran impacto en el sabor, no es sorprendente que los investigadores a menudo hayan tenido como objetivo secuestrar la producción de ésteres de levadura para diversificar las características organolépticas de muchos fermentados diversos. alimentos. La producción total de ésteres y las proporciones relativas de cada éster individual difieren dramáticamente entre especies y cepas (Steensels et al. 2014a; Padilla, Gil y Manzanares 2016 ). Por lo tanto, la forma más sencilla de variar los niveles de éster en la fermentación es variar la cepa de levadura. La ingeniería metabólica para controlar la formación de ésteres se ha centrado principalmente en ATF1 y ATF2expresión o actividad (Lilly, Lambrechts y Pretorius 2000; Hirosawa et al. 2004; Lilly et al. 2006; Swiegers et al. 2006 ). La modulación de la expresión de IAH1, una esterasa, también afecta las concentraciones de éster (Lilly et al. 2006; Zhang et al. 2012 ). La hibridación sexual también se ha aplicado con éxito para modular la producción de ésteres. Los métodos de mejoramiento han ayudado a incrementar y diversificar la producción de ésteres de ale comercial (Steensels et al. 2014a ), lager (Mertens et al. 2015 ), sake (Yoshida et al. 1993) .; Kurose y col. 2000 ), vino (Bellon et al. 2013 ) y el chocolate incluso (Meersman et al. 2016 ).

Dado que la formación de estos compuestos no confiere necesariamente una ventaja de aptitud, no existe una forma sencilla de seleccionar la producción de éster deseada en la evolución experimental, mutagénesis o configuraciones de reproducción. Por lo tanto, se han desarrollado otros enfoques para seleccionar ésteres mejorados. Crecimiento en presencia de un análogo de leucina (5.5, 5 " -trifluor-DL-leucina) selecciona para variantes con reducida retroalimentación positiva sobre la producción de leucina que se traduce en una mayor producción de alcohol de isoamilo y acetato de isoamilo (Oba et al. 2005 ). De manera similar, el crecimiento con análogos de fenilalanina ( o- fluoro- y p -fluro-DL-fenilalanina) selecciona productores de acetato de 2-feniletilo (Fukuda et al.1990, 1991 ). Ha habido intentos interesantes de mejorar selectivamente variaciones en ATF1 o ATF2 dadas las variaciones en los tipos de ésteres de acetato que se producen. El crecimiento con análogos de farnesol (1-farnesilpiridinio) favorece la actividad de Atf1 (Hirooka et al. 2005 ), mientras que la suplementación del medio con pregnenolona favorece la actividad de Atf2 (Tsutsumi et al. 2002; Kitagaki y Kitamoto 2013 ). En el último ejemplo, el esteroide dañino es metabolizado por Atf2 y, por lo tanto, selecciona cepas con mejoras en la actividad de Atf2. Esos mutantes podrían aumentar los niveles de acetato de isoamilo sin afectar al acetato de etilo.

La evolución experimental que utiliza inhibidores de la síntesis de lípidos también ha dado como resultado cepas con una producción mejorada de ésteres. La selección de aureobasidina, un inhibidor de la biosíntesis de esfingolípidos, resultó en mutaciones en MGA2 que se ha implicado en la regulación de ATF1 (Takahashi et al. 2017 ). Crecimiento en cerlulina, un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos, seleccionado para mutantes de FAS2, una sintetasa de ácidos grasos, con una producción mejorada de ésteres etílicos y el beneficio adicional de niveles reducidos de ácido acético (ver Fig.​Figura 5)5) (Ichikawa et al. 1991 ). Una cepa de sake de autoclonación equipada con esta mutación se convirtió en el primer microorganismo modificado genéticamente aprobado para uso industrial en Japón (Aritomi et al. 2004 ).

Funciones fisiológicas y ecológicas de los ésteres

El papel fisiológico de la producción de ésteres en la levadura ha sido objeto de debate durante varias décadas. Se ha planteado la hipótesis de que la síntesis de ésteres ayuda a ajustar el equilibrio redox intracelular (Malcorps y Dufour 1992 ) y que algunos ésteres ayudan a mantener la fluidez de la membrana plasmática en condiciones de estrés (Mason y Dufour 2000 ). Además, la esterificación de ácidos grasos tóxicos de cadena media puede facilitar su eliminación de las células mediante la difusión a través de la membrana plasmática (Nordström 1964b ). Si bien no se comprenden bien las funciones intracelulares, recientemente ha quedado claro que los ésteres tienen funciones importantes extracelularmente.

De los muchos compuestos volátiles producidos por la levadura, los ésteres representan uno de los grupos más importantes que pueden actuar como semioquímicos de insectos, lo que indica la presencia de frutos en descomposición (El-Sayed et al. 2005 ). Los ésteres afrutados como el acetato de isoamilo, el acetato de etilo y el acetato de 2-feniletilo representan los atrayentes centrales de varios insectos (Davis et al. 2013; Christiaens et al. 2014; Scheidler et al. 2015 ). Supresión de et al. 2014 ). El acetato de isoamilo también es responsable de la atracción de D. simulans, pero la atracción depende en gran medida de la matriz química de fondo (Günther et al. 2015 ATF1 en S. cerevisiae reduce significativamente la atracción de Drosophila melanogaster y la simple adición de acetato de isoamilo o acetato de etilo puede restaurar el comportamiento de las moscas (Christiaens). También hay ejemplos de posibles respuestas específicas de especies a varios compuestos éster. Drosophila suzukii tiene una respuesta significativamente mayor al acetato de isobutilo e isoamilo, mientras que D. melanogaster responde al hexanoato de etilo (Keesey, Knaden y Hansson 2015; Scheidler et al., Ha perdido su capacidad para detectar la mayoría de los volátiles de levadura (Goldman-Huertas et al. 2015 2015 ). El herbívoro drosophilid, Scaptomyza flava, un pariente de D. melanogaster ). Los genes que codifican los receptores neuronales responsables de detectar los ésteres se eliminan o tienen mutaciones con pérdida de función en S. flava, lo que demuestra la importante conexión entre los volátiles de la levadura y la localización de fuentes de alimentos microbianos.

El lirio de cala negro ( Arum palaestinum ) se ha aprovechado de la capacidad de las drosofílidas para detectar ésteres. Esta planta ha evolucionado para imitar los volátiles de fermentación de levadura específicamente mediante la producción de acetato de 2,3-butanodiol y acetato de acetoína para atraer a las drosofílidas para la polinización (Stökl et al. 2010 ).

Evidencia reciente indica que las interacciones dentro del microbioma de D. melanogaster pueden alterar el comportamiento de la mosca (Fischer et al. 2017 ). Mientras que las moscas se alimentan de levaduras, las bacterias del ácido láctico y acético son los principales componentes de su microbioma intestinal. Al fermentar frutas, los tres microorganismos coexisten y los microbios en crecimiento crean un perfil volátil colaborativo que mejora la atracción de D. melanogaster. Los ésteres de acetato (acetato de isobutilo, acetato de isoamilo, acetato de 2-feniletilo, acetato de 2-metilbutilo, acetato de metilo, acetato de etilo) junto con ácido acético y acetoína se determinaron como los compuestos clave en esta interacción (Fischer et al. 2017 ).

En combinación con alcoholes superiores, los ésteres pueden ser atractivos para plagas agrícolas como el gorgojo del café Araecerus fasciculatus (Coleoptera: Anthribidae) y los escarabajos Carpophilus, ya que imitan los volátiles de las frutas en fermentación (descritas en la sección anterior) (Phelan y Lin 1991; Nout y Bartelt 1998; Yang et al. 2016 ). La polilla de la manzana Cydia pomonella, una plaga común de la manzana, utiliza ésteres y otros compuestos aromáticos emitidos por las levaduras Metchnikowia para localizar sitios de oviposición adecuados (Witzgall et al. 2012 ).

Además de los insectos, la lombriz de tierra Eisenia fetida usa señales volátiles, como el pentanoato de etilo y el hexanoato de etilo, para navegar hacia su fuente de alimento Geotrichum candidum, un moho similar a la levadura que se usa con frecuencia en la industria láctea (Zirbes et al. 2011 ). Además, los ésteres emitidos por S. cerevisiae, como el acetato de metilo, el acetato de etilo, el acetato de propilo, el acetato de butilo y el acetato de amilo, tienen fuertes efectos atractivos sobre los gusanos nematodos (Balanova et al. 1979 ).

Los ésteres producidos por levaduras también pueden mediar en las interacciones huésped-parásito. Las abejas melíferas producen feromonas de alarma que contienen acetato de isoamilo que defienden la colmena contra varios depredadores y parásitos. El escarabajo Aethina tumida (Coleoptera: Nitidulidae) es atraído por el acetato de isoamilo. Los escarabajos pueden transportar la levadura Koamaea ohmeri a la colmena, que luego comienza a fermentar y producir más acetato de isoamilo en altas concentraciones. Esto amplifica la atracción de los escarabajos y da como resultado una gran infestación de escarabajos y larvas, lo que causa un daño enorme a la colmena (Torto et al. 2007 ). De manera similar, el heterotoma parasitario de avispa Leptopilinase siente atraído por el acetato de etilo (junto con el etanol y el acetaldehído), lo que lo coloca cerca de su huésped potencial, D. melanogaster (Dicke et al. 1984 ).

Al igual que los alcoholes superiores, los ésteres pueden tener efectos antifúngicos, posiblemente para eliminar la competencia por las levaduras que los producen. Pichia anomala, P. kluyveri o Hanseniaspora uvarum secretan acetato de 2-feniletilo que puede inhibir fuertemente el crecimiento y la producción de micotoxinas por el hongo Aspergillus ochraceus (Masoud, Poll y Jakobsen 2005 ).

METABOLITOS DE AMINOÁCIDOS: COMPUESTOS DE AZUFRE

La clasificación genérica de 'que contiene azufre' abre una amplia y diversa gama de compuestos a considerar que incluyen todo, desde tioles básicos (como sulfuro de hidrógeno o metanotiol) y sulfuros (sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, etc.), tioéteres y tioésteres, azufre -que contienen aldehídos y alcoholes, así como tioles polifuncionales más grandes. Dada la extensa lista de compuestos potenciales, nos centramos en la asimilación de azufre, las conexiones con el metabolismo de los aminoácidos y los compuestos de azufre de relevancia industrial.

Bioquímica de la asimilación y el metabolismo del azufre.

Todos los compuestos de azufre producidos por levaduras surgen durante el catabolismo o anabolismo de los aminoácidos metionina y cisteína que contienen azufre. Dado que estos aminoácidos se encuentran en concentraciones relativamente bajas tanto en entornos naturales como industriales, se requiere que las levaduras asimilen azufre inorgánico a través de la secuencia de reducción de sulfato ​(Figura 6). Los sulfatos se reducen secuencialmente a sulfuro que puede combinarse con una fuente de nitrógeno (O-acetil-serina u O-acetil-homoserina) para formar cisteína y, posteriormente, metionina. A partir de este punto, los aminoácidos se pueden incorporar a la proteína o volver a metabolizar para formar otros compuestos de azufre volátiles. En casos de nitrógeno bajo, la cantidad de O-acetil-serina u O-acetil-homoserina disponible es limitada y hay una sobreproducción de sulfuro. Este se convierte en sulfuro de hidrógeno para permitir la difusión fuera de la celda (Jiranek, Langridge y Henschke 1995; Spiropoulos et al. 2000; Mendes-Ferreira, Mendes-Faia y Leão 2002; Swiegers y Pretorius 2005). Además, recientemente se ha demostrado que algunos compuestos de azufre, tales como etanotiol, S-etil tioacetato y dietil disulfuro, pueden sintetizarse a partir el exceso de H 2 S, independiente de la síntesis de metionina (Kinzurik et al. 2016 ).

Figura 6.

Vía de reducción de sulfato que conduce a la producción de compuestos y aminoácidos que contienen azufre. (1) El sulfato extracelular se absorbe a través de dos transportadores, Sul1 y Sul2, y se reduce secuencialmente a sulfito y sulfuro. (2) El exceso de sulfuro puede convertirse en sulfuro de hidrógeno que se difunde fuera de la célula o (3) asimilarse en las vías de síntesis de aminoácidos. (4) La producción de α-cetobutirato vincula esta vía con la treonina y las vías de síntesis de aminoácidos ramificados ​(Figura 2). (5) Una liasa puede actuar sobre la metionina para formar metanotiol, que es un precursor importante de numerosos compuestos aromáticos que contienen azufre. (6) El metanotiol también se puede producir mediante la transaminación de metionina, que también es el primer paso de la vía de Ehrlich (Fig.​(Fig. 3).3). Adaptado de Landaud (2008), Pereira et al. ( 2008 ) y Saccharomyces Genome Database (Cherry et al. 2012 ).

A partir de metionina y cisteína recién sintetizadas o añadidas exógenamente, se pueden producir todos los demás compuestos de azufre volátiles. Algunas de estas vías no se han mapeado completamente en S. cerevisiae, pero se puede trazar un esquema general basado en estudios realizados sobre las vías del azufre en bacterias y otras especies de levaduras ​(Figura 6). Las bacterias se han estudiado más ampliamente con respecto a la producción de azufre, ya que los olores negativos generalmente se asocian con el deterioro o los aromas deseados en tipos específicos de queso que utilizan bacterias del ácido láctico (Kieronczyk et al. 2003 ). Los estudios de rastreo y los intentos de ingeniería genética para manipular los niveles de H 2 S y los compuestos de azufre más deseables han proporcionado información sobre las posibles vías biosintéticas (Arfi, Landaud y Bonnarme 2006; Cordente et al. 2012 ).

La descomposición de cisteína y metionina se ha relacionado con la producción de sulfuro de dimetilo (DMS), pero también se puede formar a partir de la reducción de sulfóxido de dimetilo (DMSO) por Mxr1 (metionina sulfóxido reductasa) (Hansen 1999 ). Para la mayoría de los otros compuestos que contienen azufre, el metanotiol se considera el precursor principal. Dos vías diferentes conducen a la producción de metanotiol: la vía de la liasa o la vía de transaminación (Fig.​(Figura 6,6, paso 5). La desmetiolación de la metionina por una liasa se comprende más ampliamente en las bacterias, pero ocurre en las levaduras (Landaud, Helinck y Bonnarme 2008 ). La vía de transaminación es esencialmente la vía de Ehrlich. El ceto-γ-metiltiobutirato intermedio (también denominado ácido 4-metiltio-2-oxobutírico o MOBA) puede sufrir una variedad de reacciones químicas y enzimáticas, incluida la conversión en metanotiol. Si MOBA continúa a través de la vía de Ehrlich, hay una producción posterior de metionol, luego metionol (por reducción) o ácido metiltiopropiónico (por oxidación). La cisteína también puede sufrir conversión en el respectivo alcohol superior, 2-mercaptoetanol. El metanetiol se puede producir mediante reacciones de oxidación o acilación (Landaud, Helinck y Bonnarme 2008 ).

Existe una categoría importante de compuestos que contienen azufre que no son sintetizados directamente por la levadura. Los tioles polifuncionales están presentes en la biomasa utilizada para la fermentación pero como precursores no volátiles. Las cistationina liasas Cys3, Irc7 y Str3 liberan los tioles polifuncionales de los conjugados de cisteína (Tominaga et al. 1998; Howell et al. 2005; Holt et al. 2011; Roncoroni et al. 2011 ).

Compuestos de azufre en la industria

Los compuestos de azufre son más relevantes en las industrias de elaboración de cerveza, vino y queso. A diferencia de los alcoholes o ésteres de fusel, algunos compuestos de azufre se clasifican como positivos mientras que otros se consideran olores negativos. Por ejemplo, el olor clásico a "huevo podrido" generalmente asociado con el azufre proviene del sulfuro de hidrógeno (H 2 S), mientras que el furfuriltiol huele a café tostado. Otros compuestos de azufre negativos incluyen metanotiol (repollo cocido), sulfuros (repollo, coliflor, ajo) y metiltioésteres (queso, cebollino) (Cordente et al. 2012 ). Curiosamente, la percepción de estos compuestos es muy específica del contexto. Si bien el DMS generalmente huele a repollo, puede transmitir las notas aromáticas deseadas a las cervezas lager y al whisky (Anness y Bamforth 1982; Hansenet al. 2002 ). De manera similar, algunos de los aromas que contienen azufre son producidos por levaduras en la superficie de quesos blandos y contribuyen a su olor distintivo (Landaud, Helinck y Bonnarme 2008 ).

Algunos tioles volátiles potenciadores del aroma son producidos por levadura de vino a partir de precursores presentes en el mosto de uva. De interés son 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP), 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) y acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA), que imparten boj (4MMP), maracuyá, toronja, grosella y aromas de guayaba (3MH y 3MHA) en el vino (Tominaga et al. 1998; Dubourdieu et al. 2006 ).

Los sulfitos pueden actuar como antioxidantes en el vino y la cerveza, además de proteger contra el deterioro bacteriano y por Brettanomyces (Suzzi, Romano y Zambonelli 1985; Divol, Toit y Duckitt 2012 ). Sin embargo, los sulfitos producidos por la levadura se encuentran en niveles relativamente bajos ya que se reducen para incorporarse a los aminoácidos. Por lo tanto, a veces se agregan antes del embotellado para ayudar a estabilizar el producto final.

Parámetros ambientales y producción de compuestos de azufre

Dado que se considera que varios compuestos de azufre afectan negativamente la calidad del producto, se han desarrollado varias estrategias para reducir su emisión (Tabla ​(Tabla 7).7). Las condiciones de bajo nitrógeno aumentan la necesidad de aminoácidos de las células de levadura, lo que aumentaría la asimilación general de azufre. Esto conduce a una mayor producción de H 2 S por lo que ha sido práctica común durante décadas para añadir fuentes de nitrógeno al medio de fermentación (Jiranek, Langridge y Henschke 1995; Mendes-Ferreira, Mendes-Faia y Leão 2004 ). Sin embargo, este efecto depende del momento de la suplementación, la cepa de levadura y la presencia de metionina (Spiropoulos et al. 2000; Mendes-Ferreira et al. 2010; Barbosa, Mendes-Faia y Mendes-Ferreira 2012 ). La disminución más fuerte de H 2Los niveles de S se obtienen cuando se agrega una fuente de nitrógeno al mismo tiempo que metionina.

Cuadro 7.

Efecto de los parámetros ambientales en la producción de compuestos de azufre.

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de compuestos de azufre	Referencia
La temperatura	Incrementar	Aumento (tioles)	Howell et al. ( 2004 ), Masneuf-Pomarède et al. ( 2.006 )
pH	Disminución	Disminuir (H 2 S, metanotiol, DMS)	Bekker y col. ( 2016 )
Oxígeno (fermentación)	Incrementar	Disminución (H 2 S, metanotiol, etanotiol, metiltioacetato, etiltioacetato, DMS)	Bekker y col. ( 2015 )
Oxígeno (post-embotellado)	Incrementar	Disminuir (H 2 S, metanotiol)	Ugliano et al. ( 2012 )
Composición media
Sulfato de cobre	Suplementacion	Disminución (H 2 S y tioles; oxidación)	Kreitman y col. ( 2016 )
Fuente de N (total)	Incrementar	Disminución (H 2 S; depende del tiempo y la concentración de metionina)	Mendes-Ferreira et al. ( 2010 ), Spiropoulos et al. ( 2000 )
Infección por Botrytis cinerea	Incrementar	Aumento (tioles)	Thibon y col. ( 2010 )

Quizás uno de los problemas más comunes en la industria del vino es encontrar un equilibrio entre limitar la producción del H 2 S indeseable y aumentar los niveles de tioles volátiles que mejoran el aroma. Las fermentaciones completas de vino a veces se tratan con sulfato de cobre, un proceso conocido como clarificación de cobre, que elimina eficazmente el H 2 S (Clark, Wilkes y Scollary 2015 ). Sin embargo, el cobre solo requiere la presencia de un grupo tiol libre para formar un complejo estable y, por lo tanto, también disminuirá los niveles de compuestos de tiol deseables. Además, esta estrategia es ineficaz para eliminar varios malos olores sulfúricos que carecen de un grupo tiol libre, como disulfuros, tioacetatos y azufre cíclico (Kreitman et al. 2016 ).

La oxigenación tanto durante la fermentación como después del embotellado también puede influir en los perfiles de compuestos de azufre volátiles en el vino. El tratamiento con oxígeno durante la fermentación puede reducir las concentraciones de H 2 S, metanotiol y etanotiol (Bekker et al. 2015 ). El efecto de la exposición después del embotellado depende de la entrada de oxígeno a través de la tapa de la botella o el corcho. Cierres más porosa permiten alguna intercambio de gases y se correlacionan con menores H 2 niveles de S y metanotiol (Ugliano et al. 2012 ). Los niveles de DMS y DMDS no se ven afectados; sin embargo, los tioles volátiles deseables también se reducen y, por lo tanto, se conservan mejor en condiciones herméticas al aire en comparación con las condiciones permeables al oxígeno (Lopes et al. 2009 ).

Factores genéticos y producción de compuestos de azufre

La producción de compuestos de azufre varía ampliamente entre S. cerevisiae cepas de y otras especies. Las estrategias de ingeniería genética se han dirigido a varios de los genes asociados con la asimilación de azufre ​(Figura 6). La mutación de Met5 o MET10 bloquea la conversión de sulfito a sulfuro y reduce H 2 producción S (Sutherland et al. 2003; Cordente et al. 2009; Linderholm. Et al 2010; Bisson, Linderholm y Dietzel 2013 ). La sobreexpresión de la cistationina sintetasa CYS4 también reduce H 2 producción S mediante el accionamiento del sulfuro hacia amino síntesis de ácido (Tezuka et al. 1992 ). La MET14 mutante limita la asimilación de azufre en general (Donalies y Stahl 2002 ). Además, mutaciones en MET2(produce O-acetil-homoserina) o SKP2 (un regulador potencial de los genes de asimilación de azufre) aumentan los niveles de sulfito y H 2 S (Hansen y Kielland-Brandt 1996; Yoshida et al. 2011 ). Los niveles de DMS se pueden reducir mediante la interrupción de MXR1, lo que impide la conversión de DMSO a DMS (Hansen et al. 2002 ).

La liberación mejorada de tioles aromáticos a partir de precursores de biomasa se puede lograr mediante variaciones en las liasas, específicamente las β-liasas IRC7 y STR3. Muchas cepas de S. cervisiae tienen una deleción de 38 pb en el gen IRC7, lo que da como resultado niveles bajos de 4MMP. La selección de cepas para la actividad β-liasa o la sobreexpresión de STR3 o una copia completa de IRC7 mejora en gran medida la liberación de 4MMP y 3MH (Holt et al. 2011; Roncoroni et al. 2011; Belda et al. 2016 ).

Funciones fisiológicas y ecológicas de los compuestos de azufre

El sulfuro de hidrógeno juega un papel importante en la fisiología de las células de levadura. Como se describió anteriormente en la sección de acetaldehído, las células de levadura exhiben oscilaciones glucolíticas, en las que coordinan su metabolismo. El sulfuro de hidrógeno también puede causar inhibición de la respiración y, por lo tanto, juega un papel en la regulación de las oscilaciones respiratorias (Sohn, Murray y Kuriyama 2000; Lloyd y Murray 2006 ).

Se ha demostrado que el metionol activa una neurona de respuesta olfativa en D. melanogaster (de Bruyne, Foster y Carlson 2001 ) y atrae a las moscas de la fruta (Farhadian et al. 2012; Knaden et al. 2012 ) pero las concentraciones utilizadas en esos estudios fueron superiores a lo que típicamente se produce fermentando levaduras. Sin embargo, se ha demostrado que los niveles naturales de metionol del vinagre y el vino provocan una respuesta antenal de D. suzukii y cuando se mezcla con otros compuestos (ácido acético, acetoína y etanol) atrae eficazmente a las moscas (Cha et al. 2014). ). Esto indica que el metionol podría desempeñar un papel ecológico relevante en la comunicación entre levaduras y drosófilos.

Las trufas albergan varias levaduras y bacterias y, aunque la producción de compuestos volátiles se superpone entre las especies, se ha especulado que las levaduras contribuyen al aroma de la trufa, definido en gran medida por compuestos sulfúricos como DMS, DMTS y 3- (metilsulfanil) -propanal (Buzzini et al. 2005; Vahdatzadeh, Deveau y Splivallo 2015 ). El DMS es una de las señales definitorias para los cerdos, que utilizan trufas como fuente de alimento, así como para los perros, que son entrenados por humanos para localizar trufas subterráneas (Talou et al. 1990 ).

COMPUESTOS FENÓLICOS

Bioquímica de la producción de compuestos fenólicos

El pretratamiento de varios polímeros de lignina de las paredes de las células vegetales es una práctica común en las industrias de combustibles y bebidas. El bioprocesamiento de estos polímeros antes del proceso de fermentación libera una variedad de furanos, ácidos carboxílicos y compuestos fenólicos que pueden inhibir en gran medida el crecimiento microbiano (Klinke, Thomsen y Ahring 2004 ). Muchas especies microbianas, como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, contrarrestan el impacto negativo convirtiendo estos compuestos en moléculas menos tóxicas. Por ejemplo, la vainillina, un guayacol fenólico, puede desintoxicarse mediante la conversión en alcohol vanilílico por la levadura Adh6 (Wang et al. 2016a). Varios de los ácidos hidroxicinámicos, como el ácido cinámico (ácido fenilacrílico), el ácido cafeico, el ácido ferúlico y el ácido p -cumárico, pueden descarboxilarse a compuestos fenólicos menos tóxicos que tienen un gran impacto en las fermentaciones industriales (Fig.​(Figura 66).

En S. cerevisiae, hay dos enzimas esenciales para la descarboxilación de los ácidos hidroxicinámicos codificados por PAD1 y FDC1 (descarboxilasa del ácido fenilacrílico y descarboxilasa del ácido ferúlico). Durante varios años, no estaba claro cómo interactuaban los genes para producir compuestos fenólicos. En algunos estudios, se asumió que PAD1 era la única enzima responsable de esta reacción, ya que la deleción o mutación resultó en la pérdida completa de actividad, pero se demostró claramente que tanto PAD1 como FDC1 son necesarios para la descarboxilación de ácidos hidroxicinámicos (Mukai et al. 2010). ). Ahora se ha demostrado que PAD1no posee actividad descarboxilasa, sino que es responsable de la formación de un mononucleótido de flavina modificado (FMN) que se requiere para la actividad descarboxilasa FDC1 (Lin et al. 2015a; Payne et al. 2015; White et al. 2015 ).

Compuestos fenólicos en la industria

Durante la fermentación, las acciones de Pad1 y Fdc1 convierten los ácidos ferúlico, p- cumárico y cafeico en 4-vinilguayacol (4-VG), 4-vinilfenol (4-VP) y 4-vinilcatecol (4-VC), respectivamente (Fig. .​(Figura 7).7). Subsequently, these compounds can be reduced to form 4-ethylguaiacol (4-EG), 4-ethylphenol (4-EP) and 4-ethylcatechol (4-VC) by vinylphenol reductase (Vanderhaegen et al.2003; Vanbeneden, Delvaux and Delvaux 2006; Hixson et al.2012). Both 4-VG and 4-EG are associated with more pleasant clove-like or spicy aromas, while 4-VP and 4-EP aromas are considered more medicinal and ‘Band-Aid’-like. As Saccharomyces generally lacks reductase activity, 4-EG, 4-EP production during fermentation is an indicator of the presence of Brettanomyces (Steensels et al.2015). These phenolic compounds are significant contributors to fermentation aromas but their role is ambiguous. In certain specialty beer styles, such as wheat, Hefeweizen, Lambic, American coolship ale and acidic ale beer, the phenolic flavors are desired and help define the style. However, the same compounds are perceived negatively in most other fermented beverages and are commonly referred to as ‘phenolic off-flavors’ (POF) (Vanbeneden 2007).

Figura 7.

Producción de compuestos fenólicos. Los ácidos hidroxicinámicos se liberan durante el preprocesamiento de la biomasa. Las células de levadura pueden descarboxilar estos compuestos tóxicos a formas menos dañinas a través de las acciones de Fdc1. Fdc1 requiere un cofactor FMN que es producido por Pad1. A continuación, los compuestos se secretan y pueden reducirse más mediante una vinilfenol reductasa, típicamente contaminando levaduras o especies bacterianas.

Parámetros ambientales y producción de compuestos fenólicos

Dada la asociación general como 'sabores extraños', se han modificado varios aspectos del proceso de fermentación para reducir la producción de compuestos fenólicos (Tabla ​(Tabla 8).8). La presencia no deseada de Brettanomyces durante la fermentación puede ser atenuada por varios inhibidores (por ejemplo, sulfitos o quitosanos) o corrientes eléctricas. La producción de compuestos fenólicos por Saccharomyces depende en gran medida de la disponibilidad de precursores en el medio de fermentación. El aumento de las concentraciones de precursores no solo aumenta la disponibilidad de sustrato, sino que también activa la transcripción de PAD1 y FDC1 (Vanbeneden 2007 ). Se ha demostrado que otros parámetros de fermentación, como la temperatura y la fuente de carbono, afectan la formación de compuestos fenólicos, pero no se comprenden los mecanismos subyacentes (Vanbeneden 2007; Cui et al. 2015 ).

Cuadro 8.

Efecto de los parámetros ambientales sobre la producción de compuestos fenólicos.

Parámetro	Condición	Efecto sobre la producción de compuestos fenólicos	Referencia
Brettanomyces
Composición media
Agentes antimicrobianos
(sulfito, quitosanos,…)	Suplementacion	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Portugal et al. ( 2014 )
Ácidos débiles y ácido sórbico	Suplementacion	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Wedral et al. ( 2010 )
Baja corriente eléctrica	Aplicación de ∼200 mA	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Zuehlke et al. (2013)
Campo eléctrico pulsado	Aplicación de pulsos de ∼30 kV / cm, 1–4 μs	Disminuir (inhibe el crecimiento)	Zuehlke et al. (2013)
Saccharomyces
La temperatura	Incrementar	Incrementar	Vanbeneden ( 2007 ), Cui et al. ( 2.015 )
Composición media
Fuente C	Glucosa	Aumento (en comparación con fructosa, maltosa, sacarosa, galactosa)	Desde abajo ( 2007 )
Fuente C	Fructosa, maltosa, sacarosa	Aumento (en comparación con la galactosa); disminución (en comparación con la glucosa)	Desde abajo ( 2007 )
Fuente C	Galactosa	Disminución (en comparación con glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa)	Desde abajo ( 2007 )
Presión superior	Incrementar	Disminución (aumento de CO 2 disuelto )	Desde abajo ( 2007 )
Práctica de fermentación	Recorte superior	Disminuir (menos sedimentación de levadura)	Desde abajo ( 2007 )

Factores genéticos y producción de compuestos fenólicos

Sorprendentemente, se han realizado pocos intentos para modificar la producción de compuestos fenólicos en cepas industriales. Esto se debe en parte a la simplicidad de su producción y al hecho de que muchas levaduras industriales ya han adquirido mutaciones naturales para bloquear la producción de compuestos fenólicos. Recientemente se ha establecido que la selección para PAD1 y FDC1 mutantes de pérdida de función es uno de los factores clave en la domesticación de industriales de S. cerevisiae linajes asociados con cerveza y sake producción (Gallone et al. 2016; Gonçalves et al. 2016)). Esta selección no se observa en cepas de horneado o bioetanol, ya que en estos casos, los compuestos fenólicos probablemente son menos perjudiciales, ya sea porque el sabor desaparece durante el horneado o porque el producto no está destinado al consumo. Además, para las cepas utilizadas en estilos de cerveza donde se desean compuestos fenólicos, no se observa la selección de mutaciones en estos genes.

Funciones fisiológicas y ecológicas de los compuestos fenólicos

El carácter negativo de POF de muchas levaduras industriales es especialmente sorprendente, ya que el fenotipo se conserva en todas las cepas silvestres que se han analizado actualmente, lo que indica una gran ventaja de aptitud de estos genes en entornos naturales (Gallone et al. 2016 ). Dado que los ácidos hidroxicinámicos son compuestos antimicrobianos, la capacidad de algunas levaduras para convertir estos ácidos en compuestos fenólicos menos dañinos les proporciona resistencia y promueve el crecimiento (Baranowski et al. 1980; Larsson, Nilvebrant y Jönsson 2001; Richard, Viljanen y Penttilä 2015). Además, la formación de derivados de etilo podría desempeñar un papel en el mantenimiento del equilibrio redox en la célula en condiciones limitadas de oxígeno. El bajo nivel de oxígeno mejora la actividad de la vinilfenol reductasa (Fig.​(Figura 7)7) Y, posteriormente, reduce los niveles de su cofactor, NADH (Curtin et al. 2013 ).

Drosophila melanogaster usa etil fenoles volátiles como indicadores de la presencia de ácidos hidroxicinámicos que son potentes antioxidantes dietéticos. Dado que los insectos no poseen la capacidad de detectar los ácidos directamente, han desarrollado neuronas olfativas especializadas para detectar los etil fenoles (Dweck et al. 2015 ).

CONCLUSIÓN

Los seres humanos se dieron cuenta del potencial de la fermentación hace varios miles de años y desde entonces han estado explotando la versatilidad natural de la producción de aromas de levadura. Los alimentos y bebidas fermentados ofrecen varias ventajas, entre las que se incluyen una vida útil más prolongada y un agradable efecto eufórico. Con el tiempo, los procedimientos de fermentación se volvieron más sofisticados y refinados. Con el tiempo, se hicieron evidentes otros usos para la fermentación y el uso de levadura con fines industriales generó un campo completamente nuevo de investigación y desarrollo. En la actualidad existe evidencia genética de que demuestra lo mucho que los seres humanos han impulsado la evolución de las especies de levaduras industriales para seleccionar los rasgos de aroma deseados (Gallone et al. 2016, Gonçalves et al. 2016). Además, en las últimas décadas, las nuevas tecnologías han avanzado y refinado significativamente el proceso de selección (Steensels et al. 2014b ). Ahora utilizamos cepas de levadura específicas para producir biocombustibles, compuestos farmacéuticos, sabores y aditivos aromáticos.

La selección para aromas específicos también se ha observado en cepas naturales (Gallone et al. 2016 ), pero en algunos casos, las levaduras silvestres mantienen algunos aromas que los humanos han considerado indeseables. También hay mejoras específicas de especies de varios compuestos aromáticos a través de pequeñas variaciones en los genes biosintéticos. Esto lleva a preguntas sobre qué posibles roles fisiológicos pueden tener los diferentes compuestos aromáticos y si existen ventajas de aptitud para producirlos.

La producción de compuestos aromáticos microbianos es importante tanto en entornos industriales como ecológicos. Los compuestos aromáticos a menudo señalan la conveniencia o identifican condiciones potencialmente dañinas. En muchos casos, se desconoce el papel fisiológico de la formación de aromas, pero se han propuesto varias hipótesis. Algunos aromas son simplemente subproductos de la desintoxicación de compuestos que de otro modo serían dañinos, como la conversión de ácidos hidroxicinámicos y la esterificación de ácidos grasos tóxicos de cadena media (Nordström 1964b, Klinke, Thomsen y Ahring 2004 ). Del mismo modo, las dicetonas vecinales son un resultado indirecto de secretar compuestos que de otro modo puede provocar tensión en la célula (van Bergen et al. 2016). Además, compuestos como el acetaldehído pueden coordinar las oscilaciones fisiológicas entre las células vecinas y proporcionan un contexto ecológico más amplio para la producción de aromas (Richard et al. 1996 ).

Las levaduras habitan una gran variedad de nichos ecológicos, desde las entrañas de los insectos hasta las frutas y el néctar de varias especies de plantas. Las emisiones de microorganismos pueden indicar aspectos de la idoneidad de los alimentos y el hábitat y, por lo tanto, atraer o repeler a los insectos que buscan alimento (Fig.​(Figura 8).8). Se sabe que las levaduras asociadas con los insectos proporcionan nutrición a los insectos, por lo que parecería contradictorio que las levaduras aumenten la atracción por depredadores potenciales. Sin embargo, un trabajo reciente ha demostrado que la producción de volátiles que atraen insectos por las levaduras representa una estrategia inteligente para viajar a nuevos entornos y, por lo tanto, mejora la dispersión y supervivencia de levaduras que de otro modo serían inmóviles (Davis, Boundy-Mills y Landolt 2012, Christiaens et al. 2014 ).

Figura 8.

Resumen de las funciones ecológicas de los compuestos aromáticos. Esta revisión ha resumido una variedad de funciones fisiológicas y ecológicas de los compuestos aromáticos de levadura. Esta figura muestra algunos de los principales organismos descritos para ilustrar la gran cantidad de compuestos con los que interactúan. Positivo (+) indica una interacción generalmente positiva, como atracción, mayor crecimiento o comportamiento. Negativo (-) indica una interacción negativa como crecimiento inhibido o repulsión.

Si bien hay muchos ejemplos de aromas de levadura que afectan el comportamiento de los insectos, nuestra comprensión de las interacciones entre la levadura y sus vectores utilizando señales volátiles aún está lejos de ser completa. La percepción de muchos compuestos aromáticos de levadura depende en gran medida de los efectos sinérgicos entre compuestos. Esto se observa en la industria donde los compuestos individuales se pueden enmascarar o resaltar cuando se combinan con otros compuestos. Este tipo de sinergia se manifiesta aún más claramente en la naturaleza, donde la mayoría de los compuestos volátiles de levadura provocan respuestas de comportamiento más fuertes cuando se presentan en mezclas o con un contexto químico de fondo relevante (Davis y Landolt 2013; Günther et al. 2015). Aunque sabemos bastante sobre los compuestos aromáticos individuales, las complejas interacciones entre ellos están relativamente poco estudiadas. Además, es probable que haya más compuestos aromáticos por identificar, especialmente en un contexto ecológico. Además, todavía no está claro si los receptores de insectos y animales perciben los compuestos de forma discreta o como una mezcla. Tales interacciones también podrían ser interesantes desde una perspectiva humana, especialmente en el caso de la biorremediación en la agricultura, donde los compuestos producidos por microbios pueden explotarse como repelentes de insectos o atrayentes. La plétora de interacciones ya observadas que están influenciadas por compuestos aromáticos ilustra que los microbios productores de aroma pueden desempeñar papeles importantes, aunque subestimados, en el ecosistema.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio de Verstrepen, especialmente a Karin Voordeckers, por su ayuda y sugerencias.

FONDOS

Los autores también reconocen la financiación de la Fundación de Educación Belga Estadounidense (MCD), KU Leuven (RP y JS). KJV también reconoce la financiación de una ERC Consolidator Grant CoG682009, la subvención del programa HFSP RGP0050 / 2013, la financiación del programa KU Leuven NATAR, VIB, el programa EMBO YIP, FWO y VLAIO.

Conflicto de intereses. Ninguno declarado.

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Articles from FEMS Microbiology Reviews are provided here courtesy of Oxford University Press

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5916228/