Richard Preiss1,2, Caroline Tyrawa1, Kristoffer Krogerus3,4, Lars Marius Garshol5 and George van der Merwe1*
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, Canada
2Escarpment Laboratories, Guelph, ON, Canada
3VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, Finland
4Department of Biotechnology and Chemical Technology, School of Chemical Technology, Aalto University, Espoo, Finland
5Independent Researcher, Rælingen, Norway
La producción generalizada de alimentos y bebidas fermentadas ha resultado en la domesticación de levaduras de Saccharomyces cerevisiae específicamente adaptadas a la producción de cerveza. Si bien hay evidencia de que la industrialización de la cerveza aceleró la domesticación de la levadura de cerveza, también existe un cultivo cervecero artesanal en el oeste de Noruega que ha transmitido levaduras denominadas kveik durante generaciones. Esta práctica ha resultado en levaduras ale que son típicamente altamente floculantes, fenólicas de sabor negativo (POF-), y exhiben una alta tasa de fermentación, similar a los linajes previamente caracterizados de levadura domesticada. Además, las levaduras kveik son, según informes, tolerantes a altas temperaturas, probablemente debido a la práctica tradicional de verter la levadura en mosto caliente (> 28 ° C). Aquí, caracterizamos las levaduras kveik de 9 fuentes noruegas diferentes mediante la toma de huellas dactilares por PCR, la secuenciación del genoma completo de cepas seleccionadas, las pantallas fenotípicas y las fermentaciones a escala de laboratorio. El análisis filogenético sugiere que las levaduras kveik forman un grupo distinto entre las levaduras de cerveza. Además, identificamos una nueva mutación POF-pérdida de función, así como SNP y CNV potencialmente relevantes para la termotolerancia, tolerancia alta al etanol y fenotipos de alta velocidad de fermentación de cepas kveik. También identificamos los marcadores de domesticación relacionados con la floculación en kveik. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que las levaduras kveik noruegas son un grupo genéticamente distinto de levaduras de cerveza domesticadas con propiedades altamente relevantes para el sector cervecero.
Introducción
Está claro que la actividad humana resultó en la domesticación de levaduras de Saccharomyces cerevisiae específicamente adaptadas para la producción de cerveza. Recientemente, se ha demostrado que las levaduras de cerveza industriales actuales se originaron a partir de un puñado de ancestros domesticados, con un clado mayor, "Cerveza 1", que comprende la mayoría de las levaduras ale alemanas, británicas y estadounidenses, y otro clado ". Beer 2, "que no tiene una estructura geográfica y está más relacionada con las levaduras de vino" (Gallone et al., 2016). En general, parece que la selección humana de levaduras de cerveza en el transcurso de los siglos ha dado lugar a la evolución de mecanismos para: fermentar eficazmente azúcares de mosto tales como maltosa y maltotriosa a través de duplicaciones de genes MAL; eliminar la producción de fenol off flavor (POF) por mutaciones sin sentido frecuentes en los genes PAD1 y FDC1, responsables de la producción de 4-vinylguaiacol (4-VG), generando así cepas POF negativas (POF-), y; floculan de manera eficiente, ayudando así en el procesamiento posterior del producto (McMurrough et al., 1996; Brown et al., 2010; Steensels y Verstrepen, 2014; Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016).
Independientemente de la región de origen, la levadura de cerveza probablemente se mantuvo y domesticó por reutilización (repitching) y se compartió entre generaciones de cerveceros, lo que resultó en muchas de las levaduras de cerveza domesticadas utilizadas en la actualidad (Gibson et al., 2007; Libkind et al., 2011; Steensels et al., 2014; Gallone et al., 2016). No debe suponerse, sin embargo, que la domesticación de las levaduras de cerveza ocurrió únicamente dentro de los límites de las cervecerías industriales, ya que existían tradiciones cerveceras anteriores a la industrialización de la cerveza en el norte de Europa (Nordland, 1969; Räsänen, 1975). Estos cerveceros usaban cepas de levadura que mantenían por sí mismas, y la misma levadura generalmente se usaba para preparar y hornear. Sin embargo, en Noruega y Suecia, la cerveza y los panes sin levadura son anteriores al pan con levadura debido a la falta de grano adecuado (Visted y Stigum, 1971). Las mejoras en el transporte y la creciente especialización económica causaron que la elaboración tradicional de la granja disminuyera a partir del siglo XIX, lo que junto con la entrada de la levadura comercial probablemente condujo a la desaparición de muchas levaduras cerveceras tradicionales (Nordland, 1969).
Una región donde todavía se utilizan cultivos de levadura tradicionales es el oeste de Noruega, donde una serie de cerveceros de granja han mantenido las levaduras tradicionales de esta región, algunas según se informa durante cientos de años (Figura 1; Nordland, 1969). La cerveza de granja noruega se produce predominantemente a partir de cebada malteada y normalmente se salta, y también se infunde con ramas de enebro (Nordland, 1969). Las cervezas de las granjas se conocen como maltøl o kornøl. Hasta hace poco, los cultivos de levadura, conocidos como kveik, un término dialectal para la levadura en esta región, estaban geográficamente aislados y mantenidos localmente solo por los cerveceros tradicionales. Se hipotetiza que las levaduras kveik son domesticadas, ya que las cervezas producidas usando estas levaduras son no fenólicas (POF-) y estas levaduras son potencialmente capaces de fermentar rápidamente los azúcares derivados de la malta debido a los breves tiempos de fermentación informados. Además, al igual que las levaduras de cerveza domesticadas, las levaduras kveik se mantienen y se vuelven a utilizar mediante el repicado serial (Gibson et al., 2007; Garshol, 2014; Stewart, 2015).
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| Figura 1. Distribución geográfica de las muestras de levadura Kveik para este proyecto. El mapa se generó utilizando Google Maps y Scribble Maps. Los parques, incluido el Parque Nacional Jostedalsbreen (Jostedal glacier), están resaltados en verde.
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Sin embargo, hay algunas diferencias críticas en la forma en que se usa y mantiene kveik que pueden haber influido en su evolución adaptativa y, en consecuencia, han impactado en la generación de características fenotípicas específicas. En primer lugar, kveik se ha almacenado históricamente en seco durante períodos prolongados de hasta 1 año o más (Nordland, 1969). En segundo lugar, kveik se inocula típicamente mediante el vertido en mosto de cebada de entre 28 y 40 ° C (Tabla S1 complementaria), una temperatura de fermentación muy alta para la levadura de cerveza (Caspeta y Nielsen, 2015). La temperatura más común citada en fuentes más antiguas es "leche caliente", que significa la temperatura de la leche cuando sale de la ubre, que es de aproximadamente 35 ° C (Iacobsen, 1935; Nordland, 1969; Strese y Tollin, 2015). Tercero, este mosto a menudo tiene un alto contenido de azúcar (hasta ~ 1.080 SG / 19.25 ° Platón, en comparación con un mosto típico de 1.050 SG o 12.5 ° Platón), y los cerveceros prefieren un tiempo de fermentación corto, a menudo de solo 1-2 días antes de la transferencia a un buque de servicio (Nordland, 1969; Garshol, 2014). Tradicionalmente, en las áreas de donde proceden los cultivos de levadura estudiados, el mosto estaría hecho de maltas de cebada caseras, ya que la cebada era el cultivo principal en estas áreas, y también el grano preferido para la elaboración (Hasund, 1942). La levadura se recoge típicamente de la espuma de la cerveza en fermentación, o de la suspensión del fondo después de la fermentación primaria, y se seca hasta su próximo uso (Nordland, 1969). Si la levadura se descompuso o era demasiado vieja, el cervecero pediría levadura a los vecinos, a menudo eligiendo a aquellos que eran conocidos por tener buena cerveza (Nordland, 1969). Tomados en conjunto, este entorno adaptativo para las levaduras kveik era algo diferente de la mayoría de las levaduras ale industriales, mientras que aún favorecía el posible desarrollo de rasgos domesticados.
Sorprendentemente, los registros de levadura, creados específicamente para el almacenamiento de kveik, pueden fecharse al menos desde AD 1621 (Nordland, 1969), lo que sugiere que la reutilización de kveik comenzó mucho antes de esta fecha, ya que presumiblemente la levadura se reutilizaba antes de la desarrollo de tecnología especializada para almacenamiento de levadura. Esto se alinea con, y potencialmente es anterior a, el modelado predictivo reciente de la línea de tiempo de la domesticación de levadura moderna alrededor de A.D. 1573-1604 (Gallone et al., 2016). Por lo tanto, Kveik puede ser un grupo de levaduras de cerveza que han sido domesticadas y mantenidas por una tradición cervecera aislada geográficamente, paralela a la producción de cerveza industrial.
Sin embargo, críticamente poco se entiende sobre las levaduras kveik. Si bien algunas de estas levaduras ahora se han compartido a nivel mundial, hay una falta de datos fenotípicos y genotípicos empíricos pertenecientes a este intrigante grupo de levaduras de cerveza. Aquí informamos la toma de huellas dactilares de PCR y los datos de la secuencia del genoma completo que sugieren que las levaduras kveik forman un grupo interrelacionado de levaduras de cerveza genéticamente distintas de las levaduras de cerveza domesticadas conocidas. Nuestras caracterizaciones fenotípicas y la secuenciación del genoma completo revelan evidencia de domesticación y características positivas en la producción de compuestos saborizantes y la tolerancia al estrés que sugiere el potencial de las levaduras kveik en una amplia gama de aplicaciones industriales.
Materiales y métodos
Cepas de levadura
En el estudio se analizaron un total de 9 muestras de kveik noruego y una muestra adicional de levadura de granja lituana. Siete kveik se suministraron como suspensiones líquidas, y dos se suministraron como muestras de levadura secas. Las muestras secas se rehidrataron en agua estéril. Las suspensiones líquidas de levadura se enriquecieron inoculando 50 μl de la suspensión en 5 ml de YPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, dextrosa al 2%). Las muestras se incubaron a 30 ° C durante 24 h con agitación, luego se colocaron en placas en agar Wallerstein Nutrient (WLN; Thermo Fisher CM0309), un medio diferencial para levaduras que distingue a las múltiples levaduras entre sí en una muestra sobre la base de la absorción de el tinte verde de bromocresol. Las colonias de levadura se substirieron a WLN para garantizar la pureza. Las cepas resultantes se resumen en la Tabla 1. Cepas de control adicionales para los experimentos se enumeran en la Tabla 1.
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| Tabla 1. Cepas de levadura investigadas, información de origen e identificación de secuencia.
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Extracción de ADN
El ADN se extrajo utilizando una adaptación de un método descrito anteriormente (Ausubel et al., 2002). Brevemente, se cultivaron células de levadura en 3 ml de caldo YPD a 30 ° C, 170 rpm durante 24 h, se lavaron con agua estéril y se sedimentaron. Las células se resuspendieron en 200 μl de tampón de ruptura (2% de Triton X-100, 1% de SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl). Se añadieron 0,3 g de perlas de vidrio y 200 \ mu l de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico y las muestras se sometieron a agitación vorticial continuamente a velocidad máxima durante 3 min para lisar las células. Después de la centrifugación, la capa acuosa se transfirió a un tubo limpio y se añadió 1 ml de etanol al 100%. El sobrenadante se eliminó después de otra etapa de centrifugación. El sedimento resultante se resuspendió en 400 μL de tampón TE 1X y 30 μL de RNasa A libre de DNasa 1 mg / mL y se incubó a 37 ° C durante 5 min. El sedimento se lavó entonces con 1 ml de etanol al 100% y 10 μl de acetato de amonio 4 M, seguido de otro lavado con 1 ml de etanol al 70%, y luego se resuspendió en 100 μl de ddH2O estéril.
Secuenciación de PCR e ITS
Las regiones espaciadoras transcritas internamente (ITS) de las cepas de levadura se amplificaron usando cebadores ITS1 e ITS4 (Pham et al., 2011). Las reacciones de PCR contenían 1 \ mu l de ADN genómico, 2,5 \ mu M de cada cebador, dNTP 0,4 mM, 2,5 U de ADN polimerasa Taq y tampón de reacción Taq 1X. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un Termociclador BioRad T100 bajo las condiciones descritas previamente (Pham et al., 2011). Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1X para confirmar la amplificación con éxito. Las muestras se purificaron usando el kit de purificación QIAquick PCR y se secuenciaron usando un analizador de ADN Applied Biosystems 3730. El software 4peaks se usó para realizar un control de calidad de los rastros de secuencia. Las secuencias resultantes se analizaron para homología a nivel de especie usando NCBI BLAST (blastn suite).
Huella de ADN
Las cepas de levadura se identificaron por interdelta PCR fingerprinting utilizando cebadores interdelta δ2 (5'-GTGGATTTTTATTCCAACA-3 '), δ12 (5'-TCAACAATGGAATCCCAAC-3') y δ21 (5'-CATCTTAACACCGTATATGA-3 ') (Ness et al., 1993; Legras y Karst, 2003). Los pares de cebadores seleccionados para una mayor amplificación y análisis fueron δ2 + δ12 y δ12 + δ21, que produjeron el mayor rango de bandas bien resueltas. La PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 4 min a 95 ° C, luego 35 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 46 ° C, luego 90 s a 72 ° C, seguido de un paso final de 10 min a 72 ° C (Legras y Karst, 2003). Los productos de reacción se confirmaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1X. Las muestras de PCR se purificaron luego usando un kit de purificación QIAquick PCR y se analizaron en un Bioanalizador Agilent 2100 usando el chip Agilent DNA 7500. Los patrones de bandas obtenidos usando Bioanalyzer se analizaron usando el software GelJ (Heras et al., 2015). Las comparaciones para cada conjunto de cebadores (δ2 + δ12 y δ12 + δ21) se generaron de forma independiente utilizando la característica de comparación del software, agrupando las huellas dactilares utilizando la correlación de Pearson y UPGMA (Heras et al., 2015). Las matrices de distancia individuales resultantes se combinaron usando fuse.plot en R (
https://github.com/andrewfletch/fuse.plot), que usa el algoritmo hclust para formatear y fusionar las matrices y realizar clusters jerárquicos con UPGMA. Los datos se visualizaron utilizando el software FigTree (
http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).
Contenido de ADN por citometría de flujo
La citometría de flujo se realizó en seis cepas kveik para estimar la ploidía esencialmente como se describe por Haase y Reed (2002). Las células se cultivaron durante la noche en medio YPD, y 1 x 107 células ~ se lavaron con 1 ml de 50 mM de tampón de citrato. Las células se fijaron luego con etanol al 70% frío, y se incubaron durante la noche a -20 ° C. Después, las células se lavaron con tampón de citrato 50 mM (pH 7,2), se resuspendieron en tampón de citrato 50 mM que contiene 0,25 mg ml-1 de ARNasa A y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Después, se añadió 1 mg ml-1 de proteinasa K, y las células se incubaron durante 1 hora a 50 ° C. Después, las células se tiñeron con SYTOX Green (2 μM, Life Technologies, EE. UU.), Y su contenido de ADN se determinó usando un citómetro FACSAria IIu (Becton-Dickinson, EE. UU.). Los contenidos de ADN se estimaron comparando las intensidades de fluorescencia con las cepas de referencia haploides de S. cerevisiae (CEN.PK113-1A) y diploides (CEN.PK). Se recolectaron cien mil eventos por muestra durante la citometría de flujo. Los datos se procesaron con el paquete "flowCore" (Hahne et al., 2009) en R, mientras que las intensidades medias de fluorescencia máxima se estimaron con la función "normalmixEM" del paquete "mixtools" (Benaglia et al., 2009) en R.
Secuenciación y Análisis del Genoma
Los genomas completos de ocho cepas (seis cepas kveik y dos cepas cerveceras comerciales como controles, véase la Tabla 1) fueron secuenciados por Genome Québec (Montreal, Canadá). En resumen, se aisló el ADN como se describió anteriormente, después de lo cual se preparó una biblioteca Illumina TruSeq LT de 150 pares de bases por pares para cada cepa y la secuenciación se llevó a cabo con un instrumento HiSeqX. Las lecturas de secuenciamiento se analizaron con calidad con FastQC (versión 0.11.5) (Andrews, 2010) y se recortaron y se filtraron con Trimmomatic (versión 0.36; consulte la Tabla complementaria S2 para conocer los parámetros) (Bolger et al., 2014). Las lecturas fueron alineados a un genoma de S. cerevisiae S288c (R64-2-1) de referencia utilizando SpeedSeq (0.1.0) (Chiang et al., 2015). La calidad de las alineaciones se evaluó con QualiMap (2.2.1) (García-Alcalde et al., 2012). El análisis de variantes se realizó en lecturas alineadas utilizando FreeBayes (1.1.0-46-g8d2b3a0l; consulte la Tabla Suplementaria S2 para conocer los parámetros) (Garrison y Marth, 2012). Las variantes en todas las cepas se llamaron simultáneamente (multi-muestra). Antes del análisis de variante, las alineaciones se filtraron a un MAPQ mínimo de 50 con SAMtools (1.2; consulte la Tabla S2 complementaria para ver los parámetros) (Li et al., 2009). Anotación y efecto de predicción de las variantes se realizó con SnpEff (1.2; ver el cuadro complementario S2 para los parámetros) (Cingolani et al, 2012).. Se estimaron las variaciones en el número de copias de los cromosomas y los genes en función de la cobertura con Control-FREEC (11.0; consulte la Tabla Suplementaria S2 para conocer los parámetros) (Boeva et al., 2012). Se identificaron variaciones en el número de copias estadísticamente significativas usando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (p <0.05). La cobertura mediana y el recuento de SNP heterocigotos en ventanas de 10.000 pb se calcularon con BEDTools (2.26.0) (Quinlan y Hall, 2010) y se visualizaron en R.
Análisis filogenético y de la estructura de la población
Antes del análisis filogenético y de la estructura de la población, se llamaron genotipos de consenso para las cepas secuenciadas a partir de las variantes identificadas utilizando BCFtools (1.2) (Li, 2011). Debido a los altos niveles de heterocigosidad (> 50,000 SNP heterocigóticos) en las seis cepas kveik, también se intentó la eliminación del haplotipo utilizando WhatsHap (0.14.1) (Martin et al., 2016). WhatsHap es una herramienta de fase basada en lectura, que utiliza lecturas de secuencia mapeadas que abarcan al menos dos variantes heterocigóticas para inferir la fase. Los haplotipos de consenso se invocaron a partir de las variantes de fase utilizando BCFtools. Conjuntos de genoma de las 157 cepas de S. cerevisiae descritas en Gallone et al. (2016) fueron recuperados de NCBI (BioProject PRJNA323691). Además, el ensamblaje del genoma de Saccharomyces paradoxus CBS432 se obtuvo de
https://yjx1217.github.io/Yeast_PacBio_2016/data/ (Yue et al., 2017) para ser utilizado como un grupo externo. Múltiples alineamientos de secuencia de los genotipos de consenso de las ocho cepas secuenciadas y los 158 conjuntos se realizó con la tubería NASP (1.0.0) (Roe et al., 2016) utilizando S. cerevisiae S288c (R64-2-1) como referencia genoma Se extrajo una matriz de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en las 167 cepas de las secuencias alineadas. Los SNP se anotaron con SnpEff (Cingolani et al., 2012) y se filtraron de la siguiente manera: solo se conservaron los sitios que estaban en la secuencia codificante de genes, presentes en las 167 cepas y con una frecuencia de alelos minoritarios> 1% (una cepa) . La matriz filtrada contenía 4161584 SNP (142120 sitios). Se estimó un árbol filogenético de máxima verosimilitud utilizando IQ-TREE (1.5.5, ver Tabla Suplementaria S2 para los parámetros) (Nguyen et al., 2015). IQ-TREE se ejecutó utilizando el modelo "GTR + F + R4" y 1000 réplicas de arranque ultrarrápido (Minh et al., 2013). El árbol de máxima verosimilitud resultante se visualizó en iTOL (Letunic y Bork, 2016) y se enraizó en S. paradoxus CBS432. Los pasos anteriores de alineación de secuencia múltiple en adelante se repitieron con los haplotipos de consenso en fase de las seis cepas kveik.
La estructura de la población de 165 cepas se investigó utilizando los algoritmos basados en modelos en ESTRUCTURA (2.3.4, ver Tabla Suplementaria S2 para los parámetros) (Pritchard et al., 2000) y fastStructure (1.0; ver Tabla Suplementaria S2 para los parámetros) (Raj et al., 2014). Ambas herramientas se ejecutaron en múltiples hilos usando structure_threader (1.2.4; ver la Tabla Suplementaria 2 para los parámetros) (Pina-Martins et al., 2017). La matriz de SNP producida a partir del alineamiento de secuencia múltiple se filtró utilizando PLINK (1.9; consulte la Tabla Suplementaria S2 para conocer los parámetros) (Purcell et al., 2007) mediante la eliminación de sitios en desequilibrio de ligamiento (usando un tamaño de ventana de 50 SNP, 5 pasos de SNP). y umbral por pares de 0.5) y con una frecuencia de alelos menores <5%. Además, los SNP de S. cerevisiae S288c y S. paradoxus CBS432 se excluyeron del análisis de la estructura de la población. La matriz SNP adelgazada, que ahora consta de 26583 sitios, se usó como entrada tanto para STRUCTURE como para fastStructure, que se ejecutaron para 1 a 11 poblaciones ancestrales (K). La matriz SNP está disponible como la Hoja de datos suplementarios 1. El algoritmo ESTRUCTURA se ejecutó en 10 réplicas independientes para cada valor K y con un período inicial de grabación de 100.000 iteraciones, seguido de 100.000 iteraciones de muestreo. El número de poblaciones ancestrales (K) que mejor representaba este conjunto de datos se eligió según el "método Evanno" (Evanno et al., 2005; Earl y vonHoldt, 2012) para los resultados de ESTRUCTURA con ESTRUCTURA COSECHADORA y por el valor K que maximizó probabilidad marginal para los resultados de fastStructure (Raj et al., 2014). Los resultados de ESTRUCTURA finalmente se agruparon con el servidor CLUMPAK en línea (Kopelman et al., 2015). Los resultados se trazaron en parcelas tipo "distruct" en R. El análisis del componente principal de la matriz SNP adelgazada producida para el análisis de estructura de la población también se realizó usando el paquete SNPRelate (Zheng et al., 2012). Las diversidades de nucleótidos dentro y entre las poblaciones se estimaron en R utilizando el paquete PopGenome (Pfeifer et al., 2014).
Preparación del mosto
El mosto utilizado para la fermentación de la cerveza y la propagación de la levadura se obtuvo de una cervecería comercial, Royal City Brewing (Guelph, ON). El mosto con lúpulo fue preparado usando malta canadiense de 2 hileras con una gravedad original de 12.5 ° de Platón (1.050 de gravedad específica). El mosto se esterilizó antes de su uso a 121 ° C durante 20 min, y se enfrió a la temperatura de propagación o fermentación deseada durante la noche.
Propagación y fermentación
Las colonias de placas WLN se inocularon en 5 ml de YPD y se cultivaron a 30 ° C, 170 rpm durante 24 h. Los cultivos de YPD se transfirieron a 50 ml de mosto esterilizado y se cultivaron a 30 ° C, 170 rpm durante 24 h. Estos cultivos se contaron usando un hemocitómetro y se inocularon a una velocidad de 1,2 × 107 células / ml en 50 ml de mosto esterilizado en "frascos de especias" de vidrio (frascos de vidrio con un volumen total de 100 ml con lados rectos) provistos de cámaras de aire. Estas fermentaciones a pequeña escala se realizaron por triplicado a 30 ° C durante 12 días. Se eligió una temperatura de 30 ° C como la temperatura de fermentación, ya que es una temperatura común en la fabricación noruega de la granja (Tabla S1). Los tarros se incubaron sin agitar para aproximarse mejor a las condiciones típicas de fermentación de la cerveza. Los perfiles de fermentación se obtuvieron pesando los frascos de especias para medir la pérdida de peso, normalizándose frente a la evaporación del agua de las cámaras de aire.
Análisis de metabolitos de cerveza
Después de la fermentación, las muestras se recogieron y filtraron con filtros de jeringa de 0,45 μm antes del análisis de metabolitos. El análisis del metabolito del sabor se realizó utilizando HS-SPME-GC-MS (Rodríguez-Bencomo et al., 2012). Las muestras contenían 2 mL de cerveza, 0.6 g de NaCl, 10 μL de 3-octanol (0.01 mg / mL) y 10 μL de 3,4-dimetilfenol (0.4 mg / mL). 3-octanol y 3,4-dimetilfenol se usaron como estándares internos. El contenido de etanol y azúcar se midió usando HPLC y un detector de índice de refracción (RI). Las muestras se analizaron usando una columna Aminex HPX-87H, usando ácido sulfúrico 5 mM como fase móvil, en las siguientes condiciones: caudal de 0,6 ml / min, 620 psi y 60 ° C. Cada muestra contenía 400 μL de cerveza filtrada y 50 μL de isopropanol al 6% (v / v) como patrón interno.
Ensayos fenotípicos
Para determinar la tolerancia a la temperatura, la levadura cultivada durante 24 ha 170 rpm a 30 ° C en YPD se subcultivó en YPD precalentada a temperaturas específicas (30, 40, 42, 43, 45 ° C) por duplicado a una DO600 inicial de 0.1 e incubar con agitación durante 20 ha la temperatura indicada. Para determinar la tolerancia al etanol, los cultivos de levadura cultivados durante 24 ha 170 rpm a 30 ° C en YPD se subcultivaron en YPD que contenía concentraciones crecientes de etanol (YPD + EtOH 10, 12, 14, 15, 16%) por duplicado en un OD600 inicial de 0,1 e incubado con agitación durante 20 ha la temperatura indicada. Para evaluar el rendimiento de crecimiento para la tolerancia a la temperatura y el etanol, las muestras de levadura se sometieron a un decolorado usando ácido fosfórico y se tomaron medidas inmediatas de OD600 usando un espectrofotómetro (Simpson y Hammond, 1989). Para determinar la floculación, se cultivaron cultivos de levadura durante 24 ha 170 rpm a 30 ° C en YPD, y luego se inocularon 0,5 ml en 5 ml de mosto esterilizado, que se incubó durante 24 ha 170 rpm a 30 ° C. La floculación se evaluó utilizando la metodología de absorbancia espectrofotométrica del método ASBC Yeast-11 (ASBC, 2011). Los valores se expresan como% de floculación, con <20% representando levadura no floculante y> 85% representando levadura altamente floculante.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó en la fermentación, metabolito y datos fenotípicos con ANOVA de una vía y la prueba de Tukey usando el paquete "agricolae" en R (
http://www.r-project.org/). Los resultados de las pruebas estadísticas están disponibles como Hoja de datos complementarios 2.
Resultados
Kveik es un grupo genéticamente diferente de levaduras de cerveza
Para determinar si las muestras kveik originales contienen múltiples cepas de levadura, las muestras kveik se sembraron primero en agar WLN, que es un medio diferencial que permite distinguir Saccharomyces sobre la base de las diferencias en la morfología de la colonia y la absorción del colorante verde de bromocresol (Hutzler et al., 2015). Encontramos que todas menos dos de las muestras de kveik contenían más de una morfología de colonia de levadura distinta, que correspondía a cepas potencialmente únicas. El número de cepas aisladas de cultivos kveik individuales varió de 1 a 9 y ascendió a 25 y se resume en la Tabla 1.
Dado que los informes anecdóticos indican que las levaduras kveik son a menudo floculantes, demuestran una tasa de fermentación rápida y son capaces de utilizar azúcares de malta, todos los cuales son características de la domesticación (Gallone et al., 2016), nuestro objetivo fue determinar los parientes cercanos más cercanos levaduras kveik entre cepas conocidas de S. cerevisiae, y para determinar si las levaduras kveik están relacionadas entre sí. Como casi todas las levaduras ale domesticadas pertenecen a la especie S. cerevisiae, planteamos la hipótesis de que los aislamientos kveik también pertenecen a S. cerevisiae (Almeida et al., 2015; Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016). Realizamos su secuenciación y descubrimos que todas las cepas kveik excepto una se identificaron (mediante búsqueda BLAST) como S. cerevisiae (Tabla 1). Encontramos que la cepa que se origina en Muri es más estrechamente homóloga a los híbridos triples de S. cerevisiae / eubayanus / uvarum previamente identificados, presentando esta cepa de levadura en particular como un híbrido domesticado de potencial intrigante que justifica una investigación adicional (Tabla 1).
Dado que las levaduras kveik parecen ser cepas de S. cevevisiae, seguidamente preguntamos cómo se relacionan genéticamente con otras levaduras de S. cerevisiae. Para responder a esta pregunta, realizamos PCR interdelta usando los conjuntos de iniciadores δ12 / 21 y δ2 / 12 (Legras y Karst, 2003; Hutzler et al., 2015). Los elementos δ están separados por distancias amplificables en el genoma de S. cerevisiae y, en consecuencia, la PCR interdelta puede usarse para amplificar las regiones interdelta, que a su vez pueden usarse para identificar rápidamente levaduras con fines genéticos comparativos (Legras y Karst, 2003; Hutzler et al. al., 2015).
Ensayos preliminares usando los conjuntos de iniciadores δ1 / 2, δ2 / 12 y δ12 / 21 mostraron que los últimos dos conjuntos de cebadores producían el mayor rango de bandas útiles cuando se separaban mediante electroforesis en gel de agarosa. Luego ampliamos las regiones δ2 / 12 y δ12 / 21 de todas las cepas kveik y una selección de cepas de levadura que representan "Beer 1" (alemán, estadounidense, Reino Unido), "Beer 2" (Belgian Saison), sake, vino, pan , silvestres, y levaduras de destilación. La separación se realizó mediante electroforesis en gel capilar (Agilent Bioanalyzer), que proporcionó una mayor precisión y sensibilidad (Hutzler et al., 2015). El análisis de ambos conjuntos de datos δ2 / 12 y δ12 / 21 individualmente reveló que las levaduras kveik formaron un subgrupo entre las otras levaduras domesticadas, de modo que las levaduras kveik parecían estar más estrechamente relacionadas entre sí que con otras levaduras domesticadas (Figura S1 complementaria) . A continuación, creamos un análisis compuesto de los conjuntos de datos interdelta, produciendo un dendrograma que colocaba algunas cepas de cerveza muy juntas (Figura Suplementaria S2). Encontramos que un grupo de cepas de origen alemán, británico y estadounidense (WLP029, WLP002, WY1272, WLP007, BBY002) estaban representadas en el dendrograma y pueden representar el clado "Beer 1" (belga / alemán, británico, estadounidense), como fue identificado por Gallone et al. (2016). Sin embargo, las levaduras kveik formaron un grupo de levaduras relacionadas con un posible antecesor común. Las levaduras kveik parecen estar más relacionadas con las cepas de cerveza que otros grupos de levadura. Además, otras levaduras de este estudio, como la levadura híbrida Muri, una levadura de pan noruega (Idun) y la cepa de levadura lituana (Joniškelis) no parecen encajar dentro de la familia kveik. En conjunto, estos resultados sugieren que las levaduras kveik podrían representar un grupo genéticamente distinto de levaduras. Si bien no resuelve adecuadamente la filogenia debido a la falta de detalles, el método de huellas dactilares interdelta puede utilizarse para evaluar qué levaduras kveik están estrechamente relacionadas entre sí, y cuáles podrían seleccionarse para un posterior análisis de secuenciación de modo que se seleccione un rango representativo de cepas.
Para comprender mejor la genómica de kveik en relación con otras levaduras de S. cerevisiae, se secuenciaron genomas enteros de seis cepas kveik (Tabla 1) utilizando tecnología de 150 pares de pares de Illumina con una cobertura promedio de 472 × a 1,221 × (Tabla 2). Estas cepas se seleccionaron en base a los resultados de la toma de huellas dactilares de ADN para representar diferentes subgrupos de la familia kveik. Además, dos cepas de control (WLP001 y Vermont Ale) se secuenciaron e incluyeron en el análisis filogenético. Las distribuciones de citometría de flujo y de frecuencia alélica sugirieron que las seis cepas kveik eran tetraploides (Tabla 2, Figuras Suplementarias S3-S5). Sin embargo, 4/6 cepas mostraron aneuploidía debido a cromosomas CNV, y de particular interés, 3/6 cepas que contienen una copia adicional del cromosoma IX. Las cepas kveik también mostraron altos niveles de heterocigosidad, ya que el número de SNP heterocigóticos varió de ~ 54,000 a 68,000 (Tabla 2). La densidad de SNP heterocigotos fue relativamente uniforme en las cepas, con pocas regiones que hayan experimentado pérdida de heterocigosidad (Figura S6 complementaria).
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| Tabla 2. Ploidía estimada, viabilidad de esporas, cobertura media de secuenciación a lo largo del genoma de referencia S288c de S. cerevisiae y número de polimorfismos de nucleótido único (SNP) heterocigotos en las seis cepas kveik secuenciadas.
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Para examinar la relación genética entre kveik y otras cepas domesticadas de S. cerevisiae, se realizaron análisis filogenéticos y de estructura poblacional junto con secuencias genómicas publicadas en otros lugares. En primer lugar, los ensamblados del genoma de las 157 cepas de S. cerevisiae investigadas por Gallone et al. (2016) se obtuvieron de NCBI (PRJNA323691), mientras que los genotipos de consenso de las seis cepas kveik y dos de control se produjeron a partir de los SNP y los InDels cortos que se identificaron. Después de la alineación de secuencia múltiple y la identificación de SNP, se obtuvo una matriz filtrada que contenía 4161584 SNP en 142120 sitios (la matriz de SNP está disponible como Hoja de datos complementarios 1). Se infirió un árbol filogenético de máxima verosimilitud a partir de estos sitios polimórficos (Figura 2A). Los linajes principales informados en el estudio original (Gallone et al., 2016) se reconstruyeron con éxito, y las dos cepas de control se agruparon en los grupos correctos ("WLP001" en el grupo "Beer 1-US" y "Vermont Ale" en el grupo "Beer 1-UK"). De acuerdo con los resultados de la huella digital de ADN, las seis cepas kveik formaron su propio subgrupo dentro del grupo "Beer 1" y parecían genéticamente distintas de otras levaduras cerveceras, pero más cercanas a un grupo de levaduras alemanas de cerveza de trigo que contienen genomas mosaicos (beer072, 074 , 093). Para garantizar que los altos niveles de heterocigosidad en las seis cepas kveik no sesguen los resultados, también se realizó la fase de lectura de los haplotipos de cepa kveik. El análisis se repitió para los dos haplotipos en fases (Figura 2B) y la filogenia reveló que un haplotipo formaba un subgrupo dentro del grupo "Cerveza 1", mientras que el otro formaba un grupo único entre "Asia" y "Mixto". grupos. Esto sugiere un origen híbrido para kveik que consiste en una cerveza 1 y un linaje desconocido. Sin embargo, los datos del extremo apareado de Illumina no son ideales para la fase basada en lectura, ya que muchos pares de SNP heterocigotos podrían no estar conectados por un par de lectura. La secuenciación de lectura larga, por ejemplo, usando la tecnología PacBio o Nanopore, podría usarse para mejorar la calidad y la longitud de los bloques de haplotipos (Martin et al., 2016). Esto a su vez permitiría un análisis más detallado de la ascendencia de las cepas kveik.
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| Figura 2. Filogenia de las seis cepas kveik secuenciadas en comparación con dos cepas de control y las 157 cepas de S. cerevisiae secuenciadas en Gallone et al. (2016). (A) Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en SNP en 142120 sitios en 166 cepas de S. cerevisiae (enraizadas con S. paradoxus como outgroup). Los puntos negros en los nodos indican valores de soporte bootstrap <95%. Las ramas se colorean de acuerdo con el linaje, y los nombres de las cepas se colorean según el tipo (kveik, rojo, control, azul, referencia, verde). Las longitudes de las ramas representan el número de sustituciones por sitio. (B) Árbol filogenético de máxima verosimilitud producido como en (A), pero utilizando los haplotipos en fase de las levaduras kveik en lugar de sus genotipos de consenso.
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El análisis de la estructura de la población también se realizó en base a los sitios polimórficos entre las 165 cepas. En primer lugar, la matriz de SNP se filtró para eliminar los sitios en desequilibrio de ligamiento y con frecuencias alélicas menores <5%. Los algoritmos de agrupamiento STRUCTURE y fastStructure se utilizaron luego en la matriz SNP adelgazada (26583 sitios), y la estructura de la población resultante estuvo de acuerdo con la filogenia estimada. El número de poblaciones que mejor representó este conjunto de datos fue de nueve (K = 9) para ESTRUCTURA (Figura 3A) y diez (K = 10) para FastStructure (Figura Suplementaria S7). En ambos casos, las seis cepas kveik formaron su propia población única, mientras que las poblaciones principales informadas en Gallone et al. (2016) se recrearon estudios. Incluso cuando el número de poblaciones ancestrales (K) se redujo a 7 u 8, las seis cepas kveik todavía formaban una población única (Figura 3A, Figura Suplementaria S7A). El análisis de estructura rápida también se repitió para incluir los haplotipos en fase (Figura Suplementaria S7B), que reveló una ascendencia mezclada (con contribuciones de las poblaciones de Asia, Cerveza 1, Mixta y Vino) para un haplotipo (H1) y colocó el otro haplotipo ( H2) en una población con valores atípicos en el linaje "Beer 1" (beer015, 052, 095-097). Los haplotipos kveik parecen distintos de las levaduras alemanas de cerveza de trigo, y la aparente conexión de kveik a estas levaduras sugerida por la filogenia es probablemente un artefacto coincidente de que ambos grupos de cepas sean de origen mosaico / híbrido. Para respaldar el análisis de la estructura de la población, se realizó el análisis del componente principal en la matriz SNP adelgazada, que nuevamente agrupó las seis cepas kveik por separado de las otras cepas (Figura 3B). La divergencia de nucleótidos por sitio entre la población kveik y las otras poblaciones también fue más alta que las observadas entre las otras poblaciones de cerveza (Tabla S3 complementaria). Como sugieren los resultados de la huella dactilar de ADN, en comparación con las otras poblaciones de cerveza, también se observó una diversidad de nucleótidos relativamente alta dentro de la población kveik (Tabla S4 complementaria). Tomados en conjunto, los resultados del análisis filogenético y de la estructura de la población sugieren que las cepas kveik seleccionadas para la secuenciación del genoma completo son genéticamente distintas de otras levaduras domesticadas.
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| Figura 3. Estructura poblacional de las seis cepas kveik secuenciadas y las 157 cepas de S. cerevisiae secuenciadas en Gallone et al. (2016). (A) Estructura poblacional de 163 cepas de S. cerevisiae estimadas con ESTRUCTURA basada en SNP en 26583 sitios. Cada cepa a lo largo del eje x está representada por una barra vertical dividida en colores en función de las fracciones estimadas de membresía a las poblaciones resueltas para K = 6, 7, 8, 9 y 10 poblaciones ancestrales asumidas. K = 9 explica mejor la estructura de datos de acuerdo con el método "Evanno" (Evanno et al., 2005). B1O: cerveza 1-Otro. (B) Análisis de componentes principales de SNP en 26583 sitios en 163 cepas de S. cerevisiae. Los puntos están coloreados por población. |
Características de elaboración de cerveza, domesticación y potencial de esporulación en Kveik
A continuación, se intentó analizar los parámetros relevantes para la elaboración de cerveza de las levaduras kveik en la fermentación de cultivo puro. Como las culturas kveik noruegas parecen contener a menudo múltiples cepas de levadura, existe la posibilidad de que las cepas sean interdependientes. Por lo tanto, es importante determinar las características de fermentación de las cepas individuales, ya que las fermentaciones de cultivo individuales mostrarían si las cepas kveik individuales pueden fermentar adecuadamente la cerveza. La imposibilidad de hacerlo sugiere que existe una ventaja adaptada a la naturaleza de cepas múltiples de las culturas kveik. Además, nuestro objetivo fue confirmar informes anecdóticos de que estas levaduras presentan fases de latencia cortas y muestran una buena cinética de fermentación.
Realizamos fermentaciones de prueba usando las cepas kveik de cultivo puro, así como los controles de levadura ale industriales relevantes (WLP001, WLP002, WLP029, WLP570, White Labs). En particular, se eligió WLP001 porque es una de las variedades ale más populares para la producción de cerveza artesanal. Las fermentaciones se realizaron a 30 ° C, que se ha informado que es una temperatura típica para las cervezas fermentadas utilizando kveik (Garshol, 2015). Con el fin de evaluar la tasa de fermentación durante las primeras fases de la fermentación del mosto, controlamos la pérdida de CO2 en las fermentaciones a través del pesaje. Usando esta técnica, observamos que las curvas de fermentación para kveik eran a menudo favorables en comparación con la cepa de control con un tiempo de retardo de fermentación más corto observado en algunas de las cepas (Figuras 4A, B). De las cepas de control, WLP002 produjo la mayor cantidad de CO2 después de 24 h. Encontramos que 11 de las cepas kveik superaron a WLP002 a las 24 h, y la cepa de mejor rendimiento (Laerdal 2) produjo 70.6% más de CO2 en las primeras 24 h de fermentación (Figura 4B). Se realizó un ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey y se determinó que las cepas Laerdal 1 y Laerdal 2 eran significativamente más rápidas en este período a P <0,05 (hoja de datos complementarios 2). Después del período de fermentación y maduración de 12 días, también se midió la concentración de etanol de las cervezas usando HPLC. Las cepas de ale de control produjeron valores de etanol en el orden ascendente esperado: WLP002 (4.33 ± 0.64%), WLP029 (4.60 ± 0.72%), WLP001 (4.94 ± 0.25%), WLP570 (5.14 ± 0.29%). Encontramos que las levaduras kveik produjeron rendimientos de etanol esperados dentro del rango esperado para cepas de cerveza de S. cerevisiae, con rangos de atenuación aparentes que abarcan 60-90%, y rendimiento de etanol que varía de 4.01 ± 0.55 a 5.98 ± 0.32% (Figura 4C). No se observaron agrupaciones estadísticamente significativas entre los datos de etanol (hoja de datos complementarios 2). Los datos de control combinados con el rendimiento de etanol de las levaduras kveik en la fermentación de mosto indican que las levaduras kveik atenúan el mosto dentro del rango esperado de las cepas ale industriales domesticadas.
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| Figura 4. Cinética de fermentación y concentración terminal de etanol de la fermentación de mosto a pequeña escala (12.5 ° P de densidad original) a 30 ° C. (A) La evolución del CO2 en las fermentaciones se calculó pesando los recipientes de fermentación (50 ml) y normalizando la pérdida de masa en las cámaras de aire de fermentación. Los datos se multiplicaron para representar un volumen de 100 ml. Las cepas de levadura (negras) se comparan con una cepa de cerveza control (WLP001; rojo). Los primeros 3 días de fermentación se muestran. (B) Evolución del CO2 a las 24 h, calculado como en (A). Las cepas de control ale están marcadas en rojo. Las barras de error representan SD, n = 3. (C) La concentración de etanol se midió por HPLC después de 12 días de fermentación. Las barras de error representan SD, n = 3. Las cepas de control de ale están marcadas en rojo. (D) Utilización de la maltotriosa calculada a partir de los valores residuales de maltotriosa y los valores originales de maltotriosa del mosto. Las cepas de control ale están marcadas en rojo.
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Las levaduras cerveceras domesticadas se caracterizan por su capacidad para usar de manera eficiente maltosa y maltotriosa (Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016). Estos azúcares constituyen la mayoría de los azúcares fermentables en la hierba de cerveza. Como se ha observado anteriormente en cepas cerveceras (Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016), las seis cepas kveik secuenciadas mostraron variaciones considerables en el número de copias en los genes relacionados con el transporte de maltosa y maltotriosa (Tabla 3). Amplificaciones significativas en todo el locus MAL3x (que contiene la permeasa MAL31, maltasa MAL32 y factor de transcripción MAL33) y el factor de transcripción YPR196W sensible a la maltosa putativo se observaron en particular. De hecho, también observamos la utilización de maltotriosa en todas las cepas kveik en las fermentaciones de prueba de mosto, con excepción de la cepa Granvin 3 (Figura 4D).
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| Tabla 3. Número estimado de copias de los genes vinculados al transporte de maltosa en las seis cepas kveik secuenciadas.
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Para entender las contribuciones del sabor de la cerveza por las levaduras kveik, también analizamos compuestos aromáticos volátiles usando HS-SPME-GC-MS (Tabla 4). Curiosamente, encontramos que todas las levaduras kveik pertenecientes al linaje genético kveik principal (Figura 2, Figuras complementarias 1, 2) produjeron niveles mínimos de 4-vinylguaiacol (clavo de olor, humo), lo que sugiere que la familia kveik son POF- (Tabla 4) . De hecho, estos niveles fueron significativamente diferentes de la cepa de control POF + (WLP570) en todas menos una levadura kveik (Muri kveik, hoja de datos complementarios 2). Las cepas no domesticadas de S. cerevisiae tienden a tener genes PAD1 y FDC1 funcionales, lo que les permite descarboxilar los ácidos hidroxicinámicos a los vinilfenoles (Mukai et al., 2010). Muchas cepas cerveceras carecen de la capacidad de producir sabores desagradables, y los estudios han demostrado que estas cepas tienen mutaciones con pérdida de función en PAD1 y FDC1 (Mukai et al., 2014; Gallone et al., 2016; Gonçalves et al. ., 2016). Las seis cepas kveik secuenciadas aquí de hecho tienen mutaciones de pérdida de función en estos dos genes (tabla 5). Tres de estas mutaciones, 305G> A en PAD1, 460C> T en FDC1 y 501insA en FDC1, se han observado anteriormente en cepas de elaboración (Mukai et al., 2014; Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016). ), y están muy extendidos entre las cepas pertenecientes a la población "Beer 1" (Gallone et al., 2016). Notablemente, una mutación 232A> T en FDC1, causando un codón de parada prematura en la posición 78, también se observó en la cepa Stordal Ebbegarden 1. Hasta donde sabemos, esta pérdida de función de la mutación en FDC1 no se ha informado anteriormente.
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| Tabla 4. Metabolitos de sabor de fermentación (ppm) producidos por levaduras kveik durante la fermentación de mosto a 30 ° C medidos utilizando HS-SPME-GC-MS.
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| Tabla 5. Polimorfismos de un solo nucleótido con pérdida de función en PAD1 y FDC1 en las seis cepas kveik secuenciadas.
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Además, el análisis de los perfiles de éster volátiles reveló que las levaduras kveik producían concentraciones por encima del umbral de tres ésteres de ácidos grasos de levadura: caproato de etilo (piña tropical, umbral 0,21 ppm), caprilato de etilo (tropical, manzana, coñac, umbral 0,9 ppm). y decanoato de etilo (manzana; umbral 0,2 ppm) (Engan, 1972; Meilgaard, 1982; Verstrepen y otros, 2003; Comuzzo et al., 2006). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en las concentraciones de estos ésteres con respecto a las diversas cepas de control. El acetato de isoamilo (banana, umbral de 1,2 ppm) se detectó por encima del umbral y significativamente más alto en WLP570 (hoja de datos complementarios 2), lo que indica que no es un componente éster importante en el perfil de sabor de las levaduras kveik o para la otra cerveza industrial son. Curiosamente, se identificaron mutaciones de pérdida de función en los genes ATF1 y ATF2 relevantes para los ésteres de acetato entre 4/6 de las cepas kveik secuenciadas (Tabla S5 complementaria). Sin embargo, solo una de estas mutaciones fue homocigota ("Laerdal 2", codón de parada perdido de ATF1 homocigoto) y no se relacionó con la formación de éster de acetato inferior en las fermentaciones de cerveza (Tabla 4). Además, los niveles de isobutanol fueron significativamente más bajos entre las levaduras de 3 kveik en comparación con las cepas ale de control, lo que sugiere que kveik puede ser capaz de producir menos alcohol fusel (tabla 4, hoja de datos complementarios 2).
También analizamos la viabilidad de las esporas de las 6 levaduras kveik secuenciadas. Se observó viabilidad de esporas razonable (40,6-63,4%) en 5/6 de las cepas, con una cepa ("Stordal Ebbegarden 1") que muestra una baja viabilidad de las esporas (Tabla 2). Curiosamente, todas las cepas kveik secuenciadas contienen una mutación de pérdida de función en RMR1, una proteína requerida para la recombinación meiótica (Jordan et al., 2007). Esta mutación (726A> T que causa el codón de detención perdido) solo es homocigota en la cepa "Stordal Ebbegarden 1", lo que puede explicar por qué esta cepa demostró una baja viabilidad de las esporas.
Termotolerancia, tolerancia al etanol y floculación en Kveik
Dado que los ensayos de fermentación iniciales demostraron que las levaduras kveik son en gran parte POF y producen sabores de ésteres frutales deseables, seguidamente investigamos la tolerancia al estrés y la floculación de estas levaduras para determinar mejor su utilidad potencial y confirmar estas características adicionales de domesticación. Teniendo en cuenta los informes de fermentación a alta temperatura de cerveceros noruegos tradicionales (Nordland, 1969; Garshol, 2014), controlamos el crecimiento de las levaduras kveik junto con levaduras ale conocidas como cepas de control (WLP001; ale americana, WLP029; ale alemana, WLP570; Ale belga, WLP002; ale británica) bajo condiciones de crecimiento a temperatura normal y alta (30-45 ° C).
Encontramos que 19/25 cepas kveik crecieron a> 1.0 OD600 a 40 ° C, mientras que solo 1/4 de las cepas ale control (WLP570) crecieron a esta densidad óptica a 40 ° C (Tabla 6). Además, las cepas de 11/25 kveik crecieron a> 0.4 OD600 a 42 ° C, mientras que solo una de las cepas ale de control (WLP570) fue capaz de hacerlo. Sorprendentemente, 19/25 cepas kveik al menos duplicaron su densidad celular a 43 ° C con la densidad óptica máxima a esta temperatura observada para Laerdal 1 (OD 600 0.44). Curiosamente, una de las cepas de control (WLP570) también mostró crecimiento a 43 ° C (OD 600 0.39). Estos datos indican que la tolerancia a altas temperaturas es común entre las levaduras kveik, y que la tolerancia a altas temperaturas a menudo es limitada entre las cepas ale americanas / británicas / alemanas (Gallone et al., 2016). En particular, las cepas kveik mostraron un crecimiento de hasta 43 ° C, acercándose al límite teórico, y el umbral tecnológico superior actual para el crecimiento celular de S. cerevisiae (Caspeta et al., 2013, 2016; Caspeta y Nielsen, 2015). Todas las cepas no crecieron a 45 ° C (datos no mostrados). Varias mutaciones en la levadura se han relacionado con la termotolerancia mejorada. En general, las levaduras kveik cayeron en agrupaciones estadísticas entre las cepas WLP001 / WLP002 / WLP029 y WLP570 (hoja de datos complementarios 2). Hemos observado mutaciones heterocigóticas de pérdida de función en varios genes relevantes para la termotolerancia, incluyendo KEX1 (proteasa de muerte celular, cepas Kveik secuenciadas 4/6), LRG1 (proteína activadora de GTPasa específica de Rho1 y regulador negativo de la pared celular controlada por PKC vía de integridad; 6/6 cepas kveik secuenciadas), SWP82 (miembro del complejo de remodelación de la cromatina SWI / SNF; 1/6 cepas kveik secuenciadas), RPI1 (modula la integridad de la pared celular; 6/6 cepas kveik secuenciadas), IRA1 / IRA2 ( Proteínas activadoras de GTPasa y reguladores inhibidores de la vía RAS-cAMP; cepas kveik secuenciadas 6/6 y 1/6, respectivamente) y CDC25 (factor de intercambio nucleotídico de guanina unido a la membrana y activador de la vía RAS-cAMP; secuencia 4/6 kveik) cepas) (Jones et al., 1991; Lorberg et al., 2001; Puria et al., 2009; Wallace-Salinas et al., 2015; Satomura et al., 2016; Huang et al., 2018; Tabla complementaria S5 )
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| Tabla 6. Tolerancia a la termotolerancia y al etanol en levaduras kveik.
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A continuación investigamos la tolerancia al etanol de las levaduras kveik en comparación con las cepas ale de control con tolerancias de etanol disponibles del proveedor (White Labs). Kveik y cepas de control se inocularon a 0,1 OD600 en medios que contenían de 10 a 16% de etanol y se desarrollaron aeróbicamente durante 20 h. Nuestros datos de control estaban en línea con las tolerancias de etanol ampliamente especificadas por los proveedores, por ejemplo, WLP570 a "Alto-10 a 15%" y WLP002 a "Medio-5 a 10%" (Tabla 6). Curiosamente, WLP570, una cepa de origen belga, mostró una alta tolerancia al etanol con evidencia de crecimiento de hasta 16% de etanol. En comparación con las cepas de origen estadounidense, británico y alemán (WLP001, WLP002, WLP029, respectivamente), las cepas kveik generalmente mostraron una tolerancia superior al etanol. 19/25 cepas kveik al menos duplicaron su densidad durante el período de crecimiento con 14% de etanol, mientras que 13/25 cepas al menos duplicaron su densidad durante el período de crecimiento con 16% de etanol. Una vez más, las levaduras kveik a menudo cayeron en agrupaciones estadísticas entre las cepas WLP001 / WLP002 / WLP029 y WLP570 (hoja de datos complementarios 2). Con excepción de una serie de cepas originarias de la muestra de Granvin, las levaduras kveik muestran altos niveles de tolerancia al etanol, lo que sugiere que la tolerancia al etanol se conserva generalmente entre las levaduras kveik y puede ser una firma de domesticación de este grupo de levadura. Apoyando los datos fenotípicos, observamos una serie de mutaciones relevantes para la tolerancia al etanol en las cepas kveik secuenciadas (Tabla Suplementaria S5). Entre estos se encuentran AGP2 (heterocigotos, 6/6 cepas), PCA1 (heterocigotos, 6/6 cepas) y VPS70 (heterocigotos, 6/6 cepas) (Teixeira et al., 2009; Voordeckers et al., 2015).
La floculación es un sello distintivo de la domesticación de la levadura, ya que esta propiedad mejora la capacidad del cervecero para cosechar levadura mediante cultivo superior o inferior en el fermentador. Evaluamos la floculación de las levaduras kveik utilizando el método de absorbancia del método de análisis ASBC Yeast-11 Flocculence (ASBC, 2011). Las cepas de control produjeron valores de floculación esperados: por ejemplo, la cepa belga (WLP570) no es floculante (2%) y la cepa británica (WLP002) es altamente floculante (98%) (Figura 5). Observamos altos niveles de floculación entre las levaduras kveik, pero esta propiedad no fue universal: 12/24 cepas tuvieron valores de floculación> 80% (altamente floculante), mientras que otros mostraron floculación muy baja (<20%, 4 cepas). Curiosamente, en la mayoría de las muestras de kveik que contienen más de una cepa, al menos una de las cepas mostró altas tasas de floculación superiores al 80% (Figura 5). Es posible que en los cultivos kveik originales de S. cerevisiae, las levaduras sufran co-floculación y, en consecuencia, algunas cepas nunca desarrollaron o necesitaron esta función (Smukalla et al., 2008; Rossouw et al., 2015). No obstante, la alta incidencia de floculación eficiente entre las levaduras kveik es un apoyo adicional a estas levaduras han sido domesticadas. Las variaciones en el número de copias relacionadas con los genes de floculación (FLO) son comunes entre las levaduras domesticadas (Dunn et al., 2012; Bergström et al., 2014; Gallone et al., 2016; Steenwyk y Rokas, 2017). Tras el examen de los datos del WGS, observamos un alto grado de variación del número de copias en los genes FLO en las cepas kveik secuenciadas (Tabla 7). Notablemente, la única cepa con muy baja floculación analizada con secuenciación del genoma completo ("Hornindal 2", 12.3%) tuvo una eliminación completa de FLO1, conocido por ser un gen crítico que confiere el fenotipo floculento (Vidgren y Londesborough, 2011). La floculación de esta cepa fue significativamente menor (P <0.05) en comparación con la cepa Hornindal 1. También vale la pena señalar que todas las levaduras kveik secuenciadas llevan un 425A> G SNP en FLO8 que causa la pérdida de un codón de parada, restaurando la funcionalidad de FLO8, que está inactiva en la cepa de referencia S288c (Liu et al., 1996).
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| Figura 5. Capacidad de floculación de las levaduras kveik. La floculación se evaluó usando la metodología de absorbancia espectrofotométrica del método ASBC Yeast-11. Los valores se expresan como% de floculación, con <20% representando levaduras no floculentas, entre 20 y 80% que representa levadura moderadamente floculante y> 80% que representa levadura altamente floculante. Las cepas se ordenan en orden de floculación. Las barras de error representan SD, n = 3.
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| Tabla 7. Variación estimada del número de copias entre los genes de floculación (FLO) en kveik.
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Discusión
Aquí presentamos evidencia que sugiere que levaduras kveik obtenidas de cerveceros noruegos representan un grupo previamente no descubierto de levaduras de cerveza genéticamente distintas y domesticadas, y que estas levaduras tienen atributos prometedores de producción de cerveza (Almeida et al., 2015; Baker et al., 2015; Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016). Nuestros datos de huellas dactilares PCR sugieren cepas de levadura kveik forman un grupo genéticamente distinto de levaduras ale. Además, el análisis de secuenciación completa del genoma de un grupo representativo de 6 cepas muestra que las levaduras kveik forman un grupo distinto probablemente relacionado con el clado "Beer 1" pero con posible ascendencia mixta cuando los haplotipos separados de las levaduras kveik se analizan por separado. La ascendencia mixta aparentemente conservada de kveik es interesante dado que las levaduras de cerveza de mosaico / origen mixto no son particularmente comunes entre ninguno de los principales grupos de levadura de cerveza (Gallone et al., 2016). Es importante destacar que nuestro análisis de las levaduras kveik noruegas sugiere que la presión de producción de alta frecuencia de la industrialización puede no ser necesaria para la domesticación de las levaduras de elaboración de cerveza.
Nuestra investigación de los atributos de producción de cerveza con ensayos de fermentación a pequeña escala, cribados fenotípicos y secuenciación del genoma reveló que la mayoría de las levaduras kveik noruegas metabolizan rápidamente los azúcares del mosto (con CNV relacionadas en genes relevantes para maltosa), son POF- (con pérdida de -funciones de función en PAD1 y FDC1), floculan de manera eficiente (con CNV en la FLO y genes relacionados), y son altamente tolerantes al etanol y termotolerantes (rasgos típicamente poligénicos). Los fenotipos de domesticación y los marcadores de domesticación genómica en kveik se alinean en gran medida con los de las levaduras de cerveza domesticadas previamente analizadas (Gallone et al., 2016; Gonçalves et al., 2016). Por lo tanto, parece que kveik se han domesticado de manera similar a las levaduras ale industrializadas modernas. El aumento de las tasas de producción de las primeras cervecerías industriales en los siglos XVII al XVIII se propuso anteriormente para proporcionar las bases para la domesticación de la levadura de cerveza (Gallone et al., 2016). Aquí mostramos que las levaduras kveik, sorprendentemente, tienen características de adaptación similares al entorno de fermentación de la cerveza a pesar de presumiblemente ser domesticadas por cerveceros de granja sin la presión de producción de alta frecuencia de un ambiente industrial de elaboración de cerveza (Gallone et al., 2016). Por lo tanto, es posible que la producción de cerveza de alta frecuencia asociada con la industrialización no sea el único mecanismo de adaptación que da como resultado las levaduras de cerveza domesticadas que se usan en la actualidad. Ya sea que se conozca o no la existencia de prácticas similares de elaboración de cerveza a pequeña escala, análogas al cultivo cervecero noruego de la granja, resultó en la domesticación de las cepas de levadura en la industrialización anterior a la cerveza 1. A medida que se dispone de más datos genómicos de levadura, es posible identificar levaduras que están más estrechamente relacionadas con kveik y comprender mejor la línea de tiempo de domesticación para estas levaduras y para otras levaduras de cerveza domesticadas.
Aproximadamente un tercio de las levaduras kveik no flocularon con alta eficiencia. Esto puede estar influenciado por el procedimiento utilizado por los cerveceros de la granja para cosechar levadura para volver a cosechar, incluida la recolección de al menos algunas de las células de levadura de fermentación superior donde la presión evolutiva para flocular sería menor. Por lo tanto, no es sorprendente que algunas cepas kveik flocuten de forma menos eficiente que otras. Sin embargo, kveik puede presentar un nuevo modelo para comprender la co-floculación de levadura dada la capacidad de alta floculación en algunos pero no todos los miembros de un cultivo mixto de levadura (p. Ej., La cultura Hornindal) (Nishihara et al., 2000; Stewart, 2015) .
Las fermentaciones de mosto revelaron que las cepas kveik producen una variedad de ésteres afrutados, con caproato de etilo, caprilato de etilo, decanoato de etilo y acetato de fenetilo por encima del umbral de detección (Tabla 3), lo que indica que estas levaduras pueden usarse para producir cervezas con carácter afrutado. Cómo se comparan las levaduras kveik con una gama más amplia de levaduras industriales de cerveza en términos de diversidad e intensidad de producción de sabor es actualmente desconocida y es una limitación del presente estudio. Hemos demostrado que las levaduras kveik ale tienen una amplia gama de valores de atenuación de mosto. Como estas levaduras son POF, un rasgo deseable para la mayoría de los estilos de cerveza (McMurrough et al., 1996), también podrían tener una amplia utilidad para la producción de cerveza, con la selección del cervecero de acuerdo con los valores objetivo deseados y los perfiles de sabor deseados .
Sorprendentemente, nuestro cribado fenotípico reveló la termotolerancia favorable y la tolerancia al etanol de estas levaduras en comparación con las levaduras de cerveza domesticadas conocidas. La adaptación al calor a largo plazo es particularmente relevante para los procesos de fermentación realizados a temperaturas elevadas, incluidos los utilizados para la producción industrial de bioetanol. Se han identificado múltiples procesos y objetivos moleculares y celulares en la adaptación de la levadura al calor. Un estudio previo que investigaba la adaptación de la levadura a ~ 40 ° C durante un período prolongado identificó SNP en genes relacionados con la reparación del ADN, la replicación, la composición de la membrana y la estructura de la membrana como marcadores genéticos específicos de la termotolerancia (Caspeta et al., 2013) . De forma similar, identificamos los SNP en: CDC25, IRA1 e IRA2, que son genes que regulan la ruta RAS / cAMP / PKA; RPI1 y LRG1, lo que afecta la integridad de la pared celular; y KEX1 y SWP82 (Puria et al., 2009; Wallace-Salinas et al., 2015; Peeters et al., 2017; Huang et al., 2018). Estas mutaciones podrían ayudar a la termotolerancia en kveik y ser rutas futuras para el desarrollo de levaduras termotolerantes. Esta característica también tiene una aplicación potencial en la elaboración, ya que la inoculación de mosto a temperaturas más altas (> 30 ° C) sin comprometer el sabor podría ayudar a limitar la costosa refrigeración necesaria para controlar las temperaturas de fermentación del mosto controladas a 18-22 ° C. (Hill, 2015).
También demostramos que la tolerancia al etanol, conocida por ser un rasgo poligénico y genéticamente complejo que involucra múltiples alelos, es una adaptación común de las levaduras kveik. Si bien las alteraciones genéticas únicas pueden aumentar de forma incremental la tolerancia al etanol, no se aproxima al fenotipo poligénico / multialélico (Lam et al., 2014; Snoek et al., 2016). Los ambientes con alto contenido de etanol generalmente alteran la estructura y la función de la membrana celular, y afectan el plegamiento de la proteína. No es sorprendente que los genes vinculados a la tolerancia al etanol a menudo se asocian con: estabilización de las paredes celulares y las membranas celulares; aumentar la capacidad de plegamiento de la proteína; mantener el gradiente electroquímico a través de la membrana plasmática; y mantener la función vacuolar por mencionar algunas (Lam et al., 2014; Snoek et al., 2016). Sorprendentemente, casi un tercio de las levaduras kveik informadas aquí podrían crecer en presencia de un 16% de etanol. En consecuencia, observamos mutaciones en genes vinculados a la tolerancia al etanol entre las cepas kveik secuenciadas, que comprenden AGP2, PCA1 y VPS70 (Teixeira et al., 2009; Voordeckers et al., 2015). Curiosamente, estas mutaciones fueron siempre heterocigotas. Dado el etanol y las tolerancias a altas temperaturas de las levaduras kveik, es posible que estas levaduras puedan beneficiar a las industrias de destilación y bioetanol cuando estos rasgos son deseados (Caspeta et al., 2016).
Ahora se sabe que todavía existe una selección más amplia de levaduras kveik noruegas tradicionales, y es posible que otras levaduras domesticadas o "nativas" puedan existir en otras ubicaciones geográficas más allá de Noruega. La secuenciación completa del genoma de levaduras kveik adicionales podría apoyar mejor los subgrupos geográficos sugeridos en el presente estudio. Además, un análisis detallado adicional de los cultivos kveik individuales (por ejemplo, el cribado de más colonias) puede revelar una mayor diversidad de cepas que la evidente aquí. La aparente naturaleza de mosaico de los genomas kveik también merece mayor investigación. Para dilucidar la ascendencia de las cepas kveik con más detalle, se podría aplicar el uso de secuenciación de lectura larga para mejorar la calidad y la longitud de los bloques de haplotipos durante la fase y ampliar el conjunto de datos del genoma, por ejemplo, con los 1.011 genomas de levadura publicados recientemente ( Peter et al., 2018), utilizado para el análisis filogenético y de la estructura de la población. Es posible que a través de una selección y secuencia fenotípica más detallada, particularmente usando tecnología de lectura prolongada, una gama más amplia de tales levaduras pueda dar como resultado una comprensión más amplia de la domesticación de levadura de cerveza dadas las notables diferencias entre producción de cerveza de granja (infrecuente, no comercial) vs. producción de cerveza industrial (frecuente, comercial).
Declaración de disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos de la secuencia del genoma completo generados para este estudio se pueden encontrar en el número de BioProject del NCBI PRJNA473622 (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA473622).
Contribuciones de autor
CT, RP y KK llevaron a cabo los experimentos descritos en este estudio. KK realizó un análisis bioinformático de los datos de la secuencia del genoma completo. RP, CT y GM diseñaron los experimentos. LG contribuyó con materiales introductorios y proporcionó cultivos de levadura. RP, KK y GM escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Fondos
Esta investigación fue financiada por un NSERC Discovery (# 264792-400922) y otorgó OMAFRA-University of Guelph Gryphons LAAIR (LAAIR2017-5321).
Declaracion de conflicto de interes
Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a Cam Fryer y Royal City Brewing por la donación de cerveza utilizada en este estudio, y a Brian Gibson por la lectura crítica del manuscrito.
Material suplementario
El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en:
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02137/full#supplementary-material
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Edited by:
Isabel Sá-Correia, Universidade de Lisboa, Portugal
Reviewed by:
Jean-luc Legras, Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), France
Jose Sampaio, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
Eladio Barrio, Universitat de València, Spain
Copyright © 2018 Preiss, Tyrawa, Krogerus, Garshol and van der Merwe. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.
*Correspondence: George van der Merwe,
gvanderm@uoguelph.ca
