Cepas de Lachancea fermentati aisladas de kombucha: conocimientos fundamentales y aplicación práctica en la elaboración de cerveza con bajo contenido de alcohol

Konstantin Bellut 1 , Kristoffer Krogerus 2 y Elke K. Arendt 1.3 *
1 Facultad de Ciencias de la Alimentación y la Nutrición, University College Cork, Cork, Irlanda
2 VTT Technical Research Center of Finland Ltd., Espoo, Finlandia
3 APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, Irlanda

Con un creciente interés en la cerveza sin alcohol y con bajo contenido de alcohol (NABLAB), los investigadores están buscando levaduras no convencionales para aprovechar sus características metabólicas especiales para su producción. Una de las especies investigadas es Lachancea fermentati , que posee la capacidad poco común de producir cantidades significativas de ácido láctico durante la fermentación alcohólica, lo que resulta en la acumulación de ácido láctico mientras exhibe una producción reducida de etanol. En este estudio, cuatro Lachancea fermentatiSe investigaron cepas aisladas de cultivos individuales de kombucha. Se realizó la secuenciación del genoma completo y las cepas se caracterizaron por características importantes de elaboración (por ejemplo, utilización de azúcar) y sensibilidades hacia los factores de estrés. Se realizó una selección en el extracto de mosto para dilucidar las diferencias dependientes de la cepa, seguido de la optimización de la fermentación para mejorar la producción de ácido láctico. Finalmente, se elaboró ​​una cerveza de bajo contenido alcohólico a escala piloto de 60 L. Los genomas de los aislados de kombucha eran diversos y podían separarse en dos grupos filogenéticos, que estaban relacionados con su origen geográfico. Comparado con Saccharomyces cerevisiaelevadura de cerveza, la sensibilidad de las cepas al alcohol y las condiciones ácidas fueron bajas, mientras que su sensibilidad al estrés osmótico fue mayor. En el cribado, la producción de ácido láctico mostró diferencias significativas dependientes de la cepa. La optimización de la fermentación mediante la metodología de superficie de respuesta (RSM) reveló un aumento de la producción de ácido láctico a una baja tasa de lanzamiento, alta temperatura de fermentación y alto contenido de extracto. Se demostró que una alta concentración inicial de glucosa conducía a la mayor producción de ácido láctico (máx. 18,0 mM). Los datos indicaron que la producción simultánea de ácido láctico y la producción de etanol ocurrieron mientras la glucosa estuviera presente. Cuando se agotó la glucosa y / o las concentraciones de ácido láctico eran altas, la producción se desplazó hacia la vía del etanol como única vía. Una cerveza baja en alcohol (<1. 3% ABV) se produjo a 60 L a escala piloto mediante fermentación detenida. La cerveza exhibió una proporción equilibrada de dulzor de azúcares residuales y acidez del ácido láctico producido (13,6 mM). Sin embargo, debido a la fermentación detenida, estaban presentes altos niveles de diacetilo, lo que podría requerir una mayor intervención del proceso para reducir las concentraciones a niveles aceptables.

Introducción

Los seres humanos han utilizado levaduras para la preparación de sus alimentos y bebidas mucho antes de que supieran de su existencia, y la elaboración de cerveza ha sido una actividad humana desde el período Neolítico ( Meussdoerffer, 2009 ). Pero no fue hasta la introducción de la elaboración de cerveza con levadura de cultivo puro por Emil Christian Hansen que los cerveceros comenzaron a seleccionar conscientemente levaduras para propósitos específicos ( Meussdoerffer, 2009 ). La especie Saccharomyces cerevisiae , especialmente, se ha aprovechado como un caballo de batalla confiable en la producción de cerveza, y los volúmenes de producción han aumentado a casi dos mil millones de hectolitros en 2018 ( Barth-Haas Group, 2019 ).

Sin embargo, las tendencias emergentes de estilo de vida, la demografía y la legislación más estricta han llevado a una desaceleración en el crecimiento del volumen de cerveza en los últimos años, mientras que el sector de cerveza sin alcohol y con bajo contenido de alcohol (NABLAB) ha experimentado un crecimiento fuerte y constante, que se prevé que continúe. ( Bellut y Arendt, 2019 ). Hay dos enfoques fundamentalmente diferentes cuando se trata de la producción de NABLAB: desalcoholización física mediante métodos térmicos o de membrana para eliminar el etanol después de su formación ( Müller et al., 2017 ), y métodos biológicos como la fermentación detenida para limitar la producción de etanol en el primer lugar ( Brányik et al., 2012 ).

Otro antiguo método biológico para la producción de NABLAB ha experimentado un renacimiento en los últimos años: la aplicación de levaduras no Saccharomyces (también llamadas levaduras no convencionales) con capacidad limitada para fermentar azúcares de mosto, lo que resulta en una baja producción de etanol. Este método ya fue mencionado en 1929 ( Glaubitz y Haehn, 1929 ), y la especie propuesta, Saccharomycodes ludwigii , ha sido investigada a fondo ( Narziß et al., 1992 ; Liu et al., 2011 ; Mohammadi et al., 2011 ; Meier -Dörnberg y Hutzler, 2014 ; Mortazavian et al., 2014 ; Saerens y Swiegers, 2014 ; De Francesco et al., 2015, 2018 ; Jiang y col., 2017 ; Bellut et al., 2018 ). Sin embargo, recientemente, la investigación en otras especies distintas de Saccharomyces para producir NABLAB ha ganado impulso ( Bellut y Arendt, 2019 ). Los investigadores han estado estudiando el aislamiento de levaduras de entornos no cereales, para aprovechar su incapacidad para consumir los azúcares de mosto más abundantes, maltosa y maltotriosa. Dichos entornos incluyen, por ejemplo, uvas y vino ( Saerens y Swiegers, 2014 ; Estela-Escalante et al., 2016 ), miel ( De Francesco et al., 2015 ), glaciares en Italia y la Antártida ( Thomas-Hall et al ., 2015 ) . ., 2010 ;De Francesco et al., 2018 ), miso japonés ( Sohrabvandi et al., 2009 ; Mohammadi et al., 2011 ) y, más recientemente, kombucha ( Bellut et al., 2018 , 2019a ).

Hasta la fecha, se han encontrado más de 27 géneros de levadura en cultivos de kombucha con hasta 25 especies diferentes que habitan en un solo cultivo ( Jayabalan et al., 2014 ; Marsh et al., 2014 ; Reva et al., 2015 ; Chakravorty et al. , 2016 ). Uno de los géneros de levadura asociados con la fermentación de kombucha es el género Lachancea , entre los cuales, Lachancea fermentati fue registrada por primera vez por Marsh et al. (2014) , y desde entonces se ha informado que es la especie de Lachancea más abundante en kombucha ( Chakravorty et al., 2016 ). L. fermentati se ha asociado principalmente con el mosto de uva y el kéfir (Porter et al., 2019b ) pero la especie se propuso recientemente como una nueva especie cervecera para crear cerveza agria o cerveza baja en alcohol ( Osburn et al., 2018 ; Bellut et al., 2019a ). Las aplicaciones propuestas están motivadas por el hecho de que las cepas del género poseen la capacidad poco común de producir cantidades significativas de ácido láctico durante la fermentación alcohólica. La producción de altas cantidades de ácido láctico por las levaduras es un rasgo poco explorado de los géneros Lachancea y Saccharomyces ( Sauer et al., 2010 ; Jolly et al., 2014 ; Hranilovic et al., 2017). La producción de ácido láctico es facilitada por la enzima ácido láctico deshidrogenasa (LDH), que cataliza la formación de ácido láctico a partir del piruvato, producto de la glucólisis. Desde un punto de vista metabólico, esta vía es un medio alternativo y simultáneo de reciclaje de NADH a NAD + , siendo la vía más común en la levadura a través de la producción de etanol ( Sauer et al., 2010 ).

La producción de ácido láctico en Lachancea fermentati ha recibido poca atención, pero se ha asociado con Lachancea thermotolerans , donde se ha demostrado que depende en gran medida de la cepa ( Porter et al., 2019b ). Osburn y col. (2018) propuso el uso de especies productoras de ácido láctico como Lachancea fermentati para producir cerveza agria de cultivo único, haciendo que el uso de bacterias del ácido láctico para agria sea redundante. Bellut y col. (2019a) propuso el uso de Lachancea fermentati para producir cerveza con bajo contenido de alcohol al detener la fermentación de un mosto diluido y explotar su producción de ácido láctico para contrarrestar la dulzura residual del mosto.

En este estudio, investigamos cuatro Lachancea fermentaticepas aisladas de cuatro cultivos individuales de kombucha. Para comprender mejor la variación en estas cuatro cepas, se realizó la secuenciación del genoma completo de los aislados y la cepa tipo CBS 707. Las cepas se caracterizaron por importantes características de elaboración como el consumo de azúcar, el comportamiento de floculación y la susceptibilidad a factores de estrés como el etanol, el pH bajo y la presión osmótica alta. Se realizó un cribado en las fermentaciones de mosto para mostrar diferencias en la producción de ácido láctico, el consumo de azúcar y la producción de subproductos de fermentación volátiles. La investigación adicional implicó una evaluación de las condiciones de fermentación y su impacto en la producción de ácido láctico. Los parámetros de fermentación estudiados fueron extracto de mosto, temperatura de fermentación y velocidad de lanzamiento, y los resultados se evaluaron mediante la metodología de superficie de respuesta (RSM). Las alteraciones del perfil de azúcar se investigaron como otra herramienta para mejorar la producción de ácido láctico en el mosto. Finalmente, se produjo una cerveza con bajo contenido de alcohol (<1,3% ABV) mediante la parada de la fermentación a una escala piloto de 60 L y la evaluación sensorial se llevó a cabo con un panel capacitado.

Materiales y métodos

Cepas de levadura

Las cepas de Lachancea fermentati KBI 1.2, KBI 3.2, KBI 5.3 y KBI 12.1 ( Tabla 1 ) se aislaron de cuatro cultivos de kombucha individuales de acuerdo con Bellut et al. (2019a) . CBS 707, la cepa tipo Lachancea fermentati , se obtuvo de la colección CBS (Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, Países Bajos). La levadura de cerveza WLP001 (California Ale Yeast) se obtuvo de White Labs (San Diego, CA, Estados Unidos).

TABLA 1

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Tabla 1. La ploidía y la cantidad de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) homocigotos y heterocigotos observados en las cepas de Lachancea fermentati en comparación con el genoma de referencia CBS 6772.

Genómica

Contenido de ADN por citometría de flujo

La citometría de flujo se utilizó para estimar la ploidía de las cepas de levadura esencialmente como lo describen Haase y Reed (2002) . Las células se cultivaron durante la noche en medio YPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, glucosa al 2%) y aproximadamente 1 x 10 7las células se lavaron con 1 ml de tampón citrato 50 mM. Las células se fijaron con etanol al 70% helado y se incubaron durante la noche a -20 ° C. Después, las células se lavaron con tampón citrato 50 mM (pH 7,2), se resuspendieron en tampón citrato 50 mM que contenía RNAsa A 0,25 mg / ml y se incubaron durante la noche a 37ºC. Luego se añadió proteinasa K a una concentración de 1 mg / ml y las células se incubaron durante 1 ha 50ºC. A continuación, las células se tiñeron con SYTOX Green (2 µM; Life Technologies, Estados Unidos) y se determinó su contenido de ADN utilizando un citómetro FACSAria IIu (Becton Dickinson, Estados Unidos). Los contenidos de ADN se estimaron comparando las intensidades de fluorescencia. Además de las cepas de L. fermentati , también se realizaron análisis en S. cerevisiaecepas de referencia haploides (CEN.PK113-1A) y diploides (CEN.PK). Las mediciones se realizaron en cultivos de levadura independientes duplicados y se recolectaron 100.000 eventos por muestra durante la citometría de flujo.

Extracción y secuenciación de ADN

El ADN se extrajo de los sedimentos utilizando el kit de ADN genómico bacteriano Sigma GenElute (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, Estados Unidos). Después del aislamiento del ADN, el ADN se cuantificó mediante el ensayo de ADN de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos) y se prepararon bibliotecas metagenómicas de escopeta con el kit de preparación de bibliotecas Nextera XT (Illumina, San Diego, CA, Estados Unidos) según lo descrito por el fabricante. Las bibliotecas finales se secuenciaron en un Illumina NextSeq utilizando un kit de salida media V2 de 300 ciclos según las pautas de Illumina. Las lecturas de secuenciación sin procesar generadas en este estudio se han enviado a NCBI-SRA con el número de BioProyecto PRJNA587400 en la base de datos de NCBI BioProject.

Bioinformática

Se analizó la calidad de las lecturas de extremos emparejados de 150 pb con FastQC ( Andrews, 2010 ) y se recortaron y filtraron con Trimmomatic ( Bolger et al., 2014 ). Las lecturas se alinearon con un genoma de referencia de L. fermentati CBS 6772 (NCBI Accession GCA_900074765.1) utilizando SpeedSeq ( Chiang et al., 2015 ). El análisis de variantes se realizó en lecturas alineadas utilizando FreeBayes ( Garrison y Marth, 2012 ). Antes del análisis de variantes, las alineaciones se filtraron a un MAPQ mínimo de 50 con SAMtools ( Li et al., 2009 ). La cobertura mediana en ventanas de 1000 pb se calculó con mosdepth ( Pedersen y Quinlan, 2018 ) y se visualizó en R.

Además, para probar si alguna de las cepas eran híbridos entre especies, las lecturas recortadas también se alinearon con un genoma de referencia concatenado que consta de los genomas ensamblados de las doce especies de Lachancea disponibles en GRYC.1 . La cobertura media en ventanas de 1000 pb se calculó nuevamente con mosdepth y se visualizó en R utilizando scripts modificados de sppIDer ( Langdon et al., 2018 ).

Para el análisis filogenético, se llamaron genotipos de consenso de las cepas de L. fermentati a partir de las variantes identificadas utilizando BCFtools ( Li, 2011 ). Se recuperó un ensamblaje del genoma de L. kluyveri CBS 3082 de GRYC 1 . Se realizó una alineación de secuencia múltiple de los genotipos consenso y conjuntos de genomas con la tubería NASP ( Sahl et al., 2016 ) utilizando L. fermentatiCBS 6772 como genoma de referencia. Se extrajo una matriz de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en las 7 cepas de las secuencias alineadas. Los SNP se filtraron de modo que solo se mantuvieran los sitios que estaban presentes en las 7 cepas y con una frecuencia de alelos menores superior al 15% (una cepa). La matriz filtrada contenía 11,517 SNP en 6,330 sitios. Se estimó un árbol filogenético de máxima probabilidad utilizando IQ-TREE ( Nguyen et al., 2015 ). IQ-TREE se ejecutó utilizando el modelo “GTR + ASC” y 1000 réplicas de arranque ultrarrápido ( Minh et al., 2013 ). El árbol de máxima verosimilitud resultante se visualizó en FigTree y se enraizó con L. kluyveri CBS 3082. Se intentó la fase de haplotipos utilizando WhatsHap ( Figura complementaria S1 ) (Martin et al., 2016 ), y dividiendo los haplotipos en función de la similitud con el genoma de referencia como lo describen Ortiz-Merino et al. (2018) .

Caracterización de cepas

Prueba de utilización de azúcar API

Se utilizó la prueba de utilización del sustrato API ID 32C (BioMérieux, Marcy-l'Étoile, Francia) para analizar el espectro bioquímico de todas las cepas de Lachancea fermentati . La preparación del inóculo y la inoculación de las tiras se realizó de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las colonias para el inóculo se cultivaron en placas de agar YPD durante 48 ha 27 ° C. Después de la inoculación, las tiras API ID 32C se incubaron durante 2 días a 28 ° C. Las muestras se evaluaron visualmente por turbidez de los pozos, diferenciando crecimiento positivo (+), negativo (-) y débil (w).

Microscopía electrónica de barrido

Se prepararon cultivos de levadura para microscopía electrónica de barrido (SEM) siguiendo el protocolo para microorganismos cultivados de Das Murtey y Ramasamy (2018) . Se tomaron colonias individuales de una placa de agar YPD y se cultivaron en caldo YPD durante 24 ha 25ºC. Se centrifugó un mililitro de muestra a 900 gdurante 2 min para la formación de sedimentos y se resuspendió en una solución de glutaraldehído al 5% preparada en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2) para la fijación. Después de 30 min, se centrifugó la muestra, se descartó el sobrenadante y se lavó el sedimento dos veces en tampón fosfato 0,1 M. En consecuencia, el sedimento se resuspendió en tetróxido de osmio al 1% preparado en tampón fosfato 0,1 M. Después de 1 h, las células se lavaron de nuevo dos veces en tampón fosfato 0,1 M. Luego se deshidrató la muestra mediante series de etanol de 35, 50, 75, 95%, etanol absoluto y hexametildisilazano (HDMS) durante 30 min por paso (dos últimos pasos de etanol dos veces), centrifugando y descartando el sobrenadante para cada cambio. Por último, se descartó el segundo HDMS y la muestra se dejó secar durante la noche en un desecador.

La muestra de levadura deshidratada se montó sobre tubos de aluminio lisos utilizando adhesivo de doble superficie de carbono y se recuperó con una capa de oro-paladio (80:20) de 5 nm utilizando un recubridor de pulverización de oro (BIO-RAD Polaron Division, sistema de recubrimiento SEM, Reino Unido) y observado bajo un voltaje de aceleración constante de 5 kV bajo un microscopio electrónico de barrido JEOL tipo 5510 (JEOL, Tokio, Japón).

Prueba de susceptibilidad antifúngica

La susceptibilidad a los antifúngicos se investigó mediante un método basado en agar en el que se utiliza una tira de material inerte impregnada con un gradiente de concentración predefinido de un único agente antifúngico para cuantificar directamente la susceptibilidad a los antifúngicos en términos de un valor de CIM (concentración mínima inhibitoria), que corresponde a la inhibición del crecimiento en una zona elíptica. Los antifúngicos probados fueron anfotericina B, fluconazol, itraconazol, voriconazol, caspofungina y flucitosina, que cubren una amplia gama de mecanismos de acción antifúngicos. Las tiras y las placas de agar RPMI se obtuvieron de Liofilchem ​​(Roseto degli Abruzzi, Italia). Los cultivos de levadura se cultivaron en agar dextrosa Sabouraud durante 48 ha 27 ° C. Las colonias bien aisladas se homogeneizaron en solución salina estéril (NaCl al 0,85%) para obtener una turbidez equivalente al estándar 0,5 de McFarland. Se empapó un hisopo estéril en el inóculo y se usó para rayar toda la superficie del agar tres veces, girando la placa 60 ° cada vez para asegurar una distribución uniforme del inóculo. El procedimiento de remojo y rayado se repitió por segunda vez. Las tiras se aplicaron cuidadosamente sobre la superficie seca del agar y las placas se incubaron a 35 ° C. Las placas se leyeron después de 24, 48 y 72 h siguiendo la guía de lectura de antimicóticos Etest (Pruebas de susceptibilidad antifúngica de BioMérieux, 2019 ). La prueba se realizó por duplicado. Si las CIM difirieron entre los duplicados, se informó la CIM más alta.

Prueba de POF

La prueba de sabor extraño fenólico se realizó de acuerdo con Meier-Dörnberg et al. (2017) . Las cepas de levadura se extendieron sobre placas de agar de levadura y moho (agar YM) que contenían solo uno de los siguientes precursores: ácido ferúlico, ácido cinámico o ácido cumarico. Después de 3 días de incubación a 25 ° C, un panel capacitado evaluó las placas olfateando para detectar cualquiera de los siguientes aromas: similar al clavo (4-vinilguajacol), similar al poliestireno (4-vinilestireno) y similar al medicamento (4 -vinilfenol). Saccharomyces cerevisiae LeoBavaricus - TUM 68 (Centro de investigación Weihenstephan para la elaboración de cerveza y la calidad de los alimentos, Freising-Weihenstephan, Alemania) se utilizó como control positivo.

Prueba de floculación

La prueba de floculación se realizó utilizando un ensayo de Helm ligeramente modificado ( Bendiak et al., 1996 ; D'Hautcourt y Smart, 1999 ). Esencialmente, todas las células se lavaron en EDTA y el período de sedimentación se extendió a 10 min. El mosto estaba compuesto de 100 g / L de extracto de malta secado por aspersión (Spraymalt Light, Muntons plc, Suffolk, Reino Unido) ajustado a 15 IBU (15 mg / ml de iso-α-ácidos; de una solución madre al 30%; Grupo Barth-Haas , Nuremberg, Alemania).

Pruebas de esfuerzo

Las pruebas de esfuerzo se realizaron en microplacas mediante la medición repetida de la absorbancia durante un período de tiempo de 96 h (Multiskan FC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos).

El sustrato para la prueba de sensibilidad al lúpulo fue 75 g / L de mosto filtrado estéril ajustado a 0, 50 y 100 mg / L de iso-α-ácidos (1 mg / L = 1 Unidad Internacional de Amargor, IBU), respectivamente mediante el uso de un alícuota de una solución madre de iso-α-ácidos al 3% en etanol al 96% (v / v) (Grupo Barth-Haas, Nürnberg, Alemania).

Para probar la sensibilidad al etanol, el extracto de mosto filtrado estérilmente se ajustó a 0, 2,5, 5, 7,5 y 10% ABV con una alícuota de etanol al 100% (v / v).

Para probar la sensibilidad al pH con ácido láctico, el mosto filtrado de forma estéril se ajustó a rangos de pH de 5,5 (sin adición de ácido) a 3,0 en pasos de 0,5 con alícuotas de ácido láctico al 80% (correspondientes a concentraciones de ácido láctico de 0; 1,7; 3,1; 6,1; 16,3; 48,4 mM).

Para probar la sensibilidad al pH mediante HCl, el mosto filtrado de forma estéril se ajustó a rangos de pH de 5,5 (sin adición de ácido) a 1,5 en pasos de 0,5 con alícuotas de HCl 2 M.

El estrés osmótico se probó ajustando el extracto de mosto filtrado de forma estéril (100 g / L de Muntons Spraymalt Light) a concentraciones de sorbitol de 0, 50, 100, 150 y 200 g / L, respectivamente.

Para la inoculación, las cepas se cultivaron en mosto esterilizado durante 24 ha 25 ° C en condiciones aeróbicas. Los pocillos de la placa de microtitulación se inocularon con una concentración de 10 5 células / ml. Los pocillos contenían 200 μL de los respectivos sustratos de mosto. Las placas se incubaron a 25 ° C y se midió la absorbancia cada 30 min a 600 nm sin agitar durante un período de tiempo de 96 h (Multiskan FC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos).

Ensayo de fermentación

Se tomaron colonias individuales de las respectivas cepas de placas de agar YPD después de 72 h de crecimiento a 25 ° C y se transfirieron a una botella de vidrio Duran estéril de 250 ml (Lennox Laboratory Supplies Ltd., Dublín, Irlanda) que contenía 150 ml de mosto de propagación que constaba de 75 g. / L de malta secada por atomización y 30 g / L de glucosa (Gem Pack Foods Ltd., Dublín, Irlanda), esterilizados a 121 ° C durante 15 min. Las botellas se cubrieron con algodón estéril y se colocaron en una incubadora con agitador orbital (incubadora-agitadora ES-80, Grant Instruments (Cambridge) Ltd., Shepreth, Reino Unido) y se incubaron durante 48 ha una agitación orbital de 170 rpm a 25ºC. ° C. El recuento celular se realizó utilizando un hemocitómetro Thoma con una profundidad de 0,1 mm (Blaubrand, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos).

El mosto de fermentación se preparó disolviendo 100 g / L de extracto de malta secado por aspersión en 1 L de agua de elaboración y se esterilizó a 121 ° C durante 15 minutos seguido de filtración a través de un filtro Whatman de grado 1V estéril (Whatman plc, Maidstone, Reino Unido) para eliminarlo. se acumulan grumos calientes durante la esterilización. Se añadieron iso-α-ácidos al mosto a una concentración de 15 mg / L (15 IBU).

Las pruebas de fermentación se realizaron en botellas de vidrio Duran estériles de 250 mL, equipadas con una esclusa de aire. Los frascos se llenaron con 150 ml de mosto. Las células de levadura para la brea se lavaron mediante centrifugación a 900 g durante 5 min y se resuspendieron en agua estéril para asegurar que no se traspasen azúcares o ácidos del mosto de propagación al mosto de fermentación. La tasa de lanzamiento fue de 107 células / ml. La temperatura de fermentación fue de 25 ° C. La fermentación se realizó hasta que no se pudo medir ningún cambio en el extracto durante dos días consecutivos.

Optimización de la producción de ácido láctico de KBI 12.1

Metodología de superficie de respuesta (RSM)

Para investigar el rendimiento de la producción de ácido láctico por KBI 12.1 en diferentes parámetros de fermentación, se realizó RSM utilizando el software DesignExpert 9 (StatEase, Minneapolis, MN, Estados Unidos). Se eligió un diseño compuesto central de tres factores, centrado en la cara, con puntos factoriales duplicados y 6 réplicas del punto central. Los factores predictores fueron extracto (5, 10, 15 ° P), temperatura (16, 22, 28 ° C) y tasa de lanzamiento (5, 32.5, 60 × 10 6 células / mL).

El extracto de malta secado por aspersión sirvió como sustrato. La preparación, propagación e inoculación del mosto se llevó a cabo como se describe en 2.4. Se utilizó como base extracto de mosto esterilizado y filtrado de 15 ° P y se diluyó con agua estéril cuando fue necesario. El volumen de fermentación fue de 150 mL en botellas de vidrio Duran de 250 mL equipadas con una esclusa de aire. La fermentación se realizó hasta que no se pudo medir ningún cambio en el extracto durante dos días consecutivos.

Prueba de glucosa enriquecida

La preparación, propagación e inoculación del mosto se llevó a cabo como se describe en 2.4. El mosto 7 ° P se produjo a partir de 75 g de extracto de mosto en 1 L de agua. El mosto 7 ° P más glucosa al 3% se produjo a partir de 75 g de extracto de mosto y 30 g de glucosa en 1 L de agua. El mosto a 10 ° P se produjo mediante la dilución del mosto a 15 ° P de 2.5.1 con agua. El volumen de fermentación fue de 150 mL en botellas de vidrio Duran de 250 mL equipadas con una esclusa de aire. La velocidad de lanzamiento fue de 5 x 10 6 células / ml y la temperatura de fermentación fue de 25 ° C. La fermentación se realizó hasta que no se pudo medir ningún cambio en el extracto durante dos días consecutivos.

Brebaje piloto

El mosto para la preparación piloto se produjo en una planta de elaboración a escala piloto de 60 L que consta de un recipiente combinado de maceración y ebullición, una cuba de filtración y una bañera de hidromasaje (FOODING Nahrungsmitteltechnik GmbH, Stuttgart, Alemania). La malta Weyermann Pilsner se molió con un molino de dos rodillos ("Derby", Engl Maschinen, Schwebheim, Alemania) con un tamaño de separación de 0,8 mm. Se machacaron siete kilogramos de malta triturada con 30 L de agua de infusión a 50 ° C. Para aumentar la cantidad de glucosa, se añadieron 7 g de Amylo 300 (Kerry Group, Tralee, Irlanda) al inicio del macerado (1 g / kg de malta). Se empleó el siguiente régimen de maceración: 20 min a 50 ° C, 60 min a 65 ° C y 5 min a 78 ° C. La mezcla se bombeó a la cuba de filtración y se realizó la filtración después de un reposo de filtración de 15 minutos, empleando cuatro pasos de burbujeo de 5 L de agua de preparación caliente cada uno. El volumen de ebullición fue de 50 L con una densidad de 1,038 (9,9 ° P). Al comienzo de la ebullición, se añadieron 15 g de gránulos de lúpulo Magnum (10,5% de iso-α-ácidos) para un contenido de IBU calculado de 6,5. El tiempo total de ebullición fue de 45 min. Después de hervir, la gravedad se ajustó a 1,034 (8,5 ° P) con agua de infusión caliente y los precipitados de trub caliente y el residuo de lúpulo se eliminaron en la bañera de hidromasaje con un descanso de 20 min. Se bombeó mosto claro a través de un intercambiador de calor y se llenó en recipientes de fermentación de 60 L a una temperatura de 25 ° C.

La levadura se lanzó a una velocidad de lanzamiento de 5 x 10 6 células / ml. La temperatura de fermentación fue de 25 ± 1 ° C (descontrolada). Se tomaron muestras cada 12 h. Después de 36 h, se filtraron 30 L de la cerveza joven a través de un filtro de placa (Seitz K 200; Pall GmbH, Dreieich, Alemania) para detener la fermentación eliminando la levadura y se introdujeron en un barril de 50 L. La cerveza joven restante se dejó en el fermentador para que alcanzara la atenuación final. Para carbonatar la cerveza en barril, el barril se llenó repetidamente con CO 2a una presión de 1 bar a 2 ° C. Diez días después de detener la fermentación, la cerveza carbonatada se llenó en botellas de vidrio marrón de 330 ml con una llenadora manual de contrapresión (TOPINCN, Shenzen, China) y se tapó. Las botellas se pasteurizaron en una retorta piloto (APR-95; Surdry, Abadiano, Vizcaya, España) con agua pulverizada a 65 ° C durante 10 min dando como resultado aproximadamente 23 unidades de pasteurización (PU). Las botellas de cerveza se almacenaron en un lugar oscuro a 2 ° C para su posterior análisis y evaluación sensorial.

Sensorial

La cerveza Lachancea de baja graduación alcohólica producida a escala piloto (cerveza embotellada) fue probada y juzgada por un panel sensorial de 15 panelistas experimentados. Se pidió a los panelistas que evaluaran la intensidad de la fruta en el aroma, la relación dulzor / acidez (0 "demasiado dulce"; 5 "justo"; 10 "demasiado agria") y la aceptabilidad general de la cerveza de bajo contenido alcohólico en una escala 0, "no aceptable", a 10, "extremadamente aceptable". Las muestras se sirvieron a una temperatura de 12 ° C.

Analítica

Análisis de HPLC

El sobrenadante libre de células de las muestras fermentadas se analizó utilizando los siguientes métodos. Los azúcares y el etanol se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos) equipado con un detector de índice de refracción (RID) y un Sugar-Pak I 10 μm, 6,5 mm × 300 mm columna (Waters, Milford, MA, Estados Unidos) con 50 mg / L de Ca-EDTA como fase móvil y un caudal de 0,5 ml / min a 80 ° C. La diferenciación de maltosa y sacarosa se logró con una columna Nova-Pak 4 μm, 4.6 mm × 250 mm (Waters, Milford, MA, Estados Unidos) con acetonitrilo / agua 78:22 (v / v) como fase móvil y un caudal de 1,0 ml / min. El ácido láctico se cuantificó mediante HPLC (DIONEX UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos) con un detector de matriz de diodos (DAD) y un Hi-Plex H 8 μm, 7.2 SO 4 como fase móvil y un caudal de 0,5 mL / min a 60 ° C. La cuantificación se logró mediante estándares externos en un rango de calibración de 0,5 a 30 mM.

Análisis de volátiles por GC-MS

El análisis de volátiles en el sobrenadante libre de células de las muestras fermentadas se llevó a cabo como sigue. Los analitos se extrajeron mediante extracción líquido-líquido con metil-terc-butil éter directamente en el vial. El análisis se realizó utilizando una columna de polaridad media (Zebron ZB-1701, GC Cap. Column 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm; Phenomenex, Torrance, CA, Estados Unidos) instalada en un GC 7890B (Agilent Technologies, Santa Clara, CA , Estados Unidos) junto con un detector de cuadrupolo 5977B (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos). El sistema fue controlado por ChemStation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos). El método GC se estableció según lo descrito por Pinu y Villas-Boas (2017)con solo modificaciones menores. Las muestras se analizaron en el modo de monitorización de iones seleccionados (SIM). Las cuantificaciones se realizaron utilizando líneas de calibración externas.

Nitrógeno Amino Libre

El nitrógeno amínico libre (FAN) se midió usando un método de tinción basado en ninhidrina, en el que se mide la absorbancia a 570 nm frente a un estándar de glicina (Método ASBC Wort-12 A).

Análisis estadístico

Las fermentaciones y los análisis se realizaron por triplicado, a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico se realizó utilizando RStudio, Versión 1.1.463 con R versión 3.5.2 (RStudio Inc., Boston, MA, Estados Unidos; R Core Team, r-project). Se utilizó ANOVA de una vía para comparar medias y se aplicó la prueba de Tukey con intervalos de confianza del 95% para la comparación de medias por pares. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó con los paquetes R FactoMineR y Factoshiny ( Le et al., 2008 ). Los valores se dan como media ± desviación estándar.

Resultados

Las cepas de Lachancea fermentati investigadas en este estudio se aislaron de cuatro cultivos de kombucha individuales. KBI 1.2 y KBI 3.2 se originan en los Estados Unidos limítrofes, mientras que KBI 12.1 se origina en Hawái y KBI 5.3 se origina en una cultura kombucha de Australia. Se identificaron como cepas de Lachancea fermentati mediante secuenciación y comparación de la región D1 / D2 de la subunidad grande del ADNr con la base de datos pública de nucleótidos NCBI.2 ( Bellut et al., 2019a ). Se desconoce el país de origen de la cepa CBS 707. CBS 6772 se aisló de una bebida de fresa en mal estado en Corea del Sur ( Tabla 1 ).

Genómica

Para comprender mejor la variación en estas cuatro cepas, se realizó la secuenciación del genoma completo de los cuatro aislados de L. fermentati kombucha y la cepa tipo CBS707. Estos se secuenciaron con secuenciación de Illumina de extremo emparejado de 150 pb a una cobertura promedio que variaba de 115 × a 139 ×. Las lecturas se alinearon con el genoma de referencia de L. fermentati CBS 6772, y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) se llamaron con FreeBayes. Se observaron un total de 370.027 sitios variables en las cinco cepas en comparación con el genoma de referencia. Curiosamente, se observó un elevado número de SNP (> 250.000) en los tres aislamientos de kombucha originarios de Estados Unidos ( Tabla 1). Esto corresponde a una divergencia de la secuencia de nucleótidos alrededor del 2,4-2,7% en el genoma de 10,3 Mbp. La mayoría de estos SNP eran heterocigotos (> 2% de heterocigosidad), lo que sugiere que estas cepas no solo eran no haploides, sino que poseían genotipos divergentes. Los picos de frecuencia alélica a 0, 0,5 y 1 sugirieron que estas cepas eran diploides ( Figura 1B ). La heterocigosidad fue considerablemente superior a la observada, por ejemplo, en cualquiera de las 1.011 cepas de S. cerevisiae secuenciadas recientemente ( Peter et al., 2018 ) o 14 cepas de Kluyveromyces marxianus ( Ortiz-Merino et al., 2018).). El aislado de kombucha originario de Australia, KBI 5.3, y la cepa tipo CBS707 tenían alrededor de 20.000 SNP en comparación con el genoma de referencia. Aquí, la mayoría de los SNP eran homocigotos, lo que sugiere que las cepas eran diploides haploides u homocigotas ( Figura 1B ). La diversidad de nucleótidos por pares promedio (π) en este conjunto limitado de cepas fue de 0.0126, que es comparable a lo que se ha observado para Kluyveromyces marxianus ( Ortiz-Merino et al., 2018 ) y ligeramente mayor que para una población silvestre de Lachancea quebecensis . Los tres aislados de kombucha heterocigotos también contenían varias regiones donde se perdió la heterocigosidad ( Figura complementaria S1). Las regiones comunes, donde se observó pérdida de heterocigosidad (LOH) en las tres cepas, se podían encontrar en el cromosoma G y en el brazo derecho del cromosoma F.Además, KBI 12.1 tenía grandes regiones LOH en los brazos izquierdos del cromosoma F y H.

FIGURA 1

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Figura 1. (A) Intensidad de fluorescencia de cepas de control de S. cerevisiae haploides y diploides teñidas de verde SYTOX y las cinco cepas de L. fermentati durante la citometría de flujo. (B) Las distribuciones de frecuencia alélica de las variantes de un solo nucleótido observadas en las cinco cepas de L. fermentati secuenciadas . Los picos solo en 0 y 1 sugieren un solo alelo en cada sitio, mientras que los picos en 0, 0,5 y 1 sugieren dos alelos en cada sitio. (C) Un árbol filogenético de máxima probabilidad basado en SNP en 6330 sitios en los seis genomas de L. fermentati y uno de L. kluyveri (enraizados con L. kluyvericomo grupo externo). Los números en los nodos indican los valores de soporte de bootstrap. Las longitudes de las ramas representan el número de sustituciones por sitio.

Se utilizó citometría de flujo para confirmar la ploidía de las cepas. La ploidía natural de L. fermentati y otros miembros del género Lachancea parece variar, con informes de cepas tanto haploides como diploides ( Souciet et al., 2009 ; Agier et al., 2013 ; Freel et al., 2014 ; Banilas et al., 2014 ; Banilas et al., 2009 ; al., 2016 ; Hranilovic et al., 2017 ). Aquí, los tres aislados de kombucha heterocigotos aparecieron diploides, mientras que KBI 5.3 apareció haploide ( Figura 1A ). A pesar de la falta de SNP heterocigotos, la cepa de tipo CBS707 también apareció diploide. Esto está en línea con lo que se informó anteriormente para la cepa ( Agier et al., 2013). La cobertura de lectura también sugirió que CBS 707 también albergaba una tercera copia adicional del cromosoma C, mientras que no se observó aneuploidía en ninguno de los aislados de kombucha ( Figura complementaria S2 ). Las intensidades de fluorescencia de las cepas de L. fermentati durante la citometría de flujo fueron ligeramente más bajas que las de las referencias haploides y diploides de S. cerevisiae , como se puede esperar en base al tamaño más pequeño del genoma de L. fermentati.

El análisis filogenético basado en las variantes de un solo nucleótido que se observaron en los cuatro aislados de kombucha y la cepa tipo CBS 707, separó los tres aislados de kombucha heterocigotos (KBI 1.2, KBI 3.2 y KBI 12.1) en un clado separado del que contenía CBS 707 , CBS 6772 y KBI 5.3 ( Figura 1C ). Debido a la alta heterocigosidad, que puede distorsionar los resultados, intentamos separar los dos haplotipos utilizando la variante de fase con WhatsHap y asignando los haplotipos en función de la similitud con el genoma de referencia como lo describen Ortiz-Merino et al. (2018) . En ambos casos, se pudo encontrar un haplotipo junto con CBS 707, CBS 6772 y KBI 5.3, mientras que el otro haplotipo formó un clado separado ( Figura complementaria S3). Por lo tanto, es probable que los aislados de kombucha heterocigotos hayan surgido a través de la reproducción entre cepas de dos poblaciones diferentes de L. fermentati . Para asegurar que las cepas heterocigotas no fueran híbridos interespecíficos, las lecturas de secuenciación también se alinearon con un genoma de referencia concatenado que consta de los genomas de 12 especies del género Lachancea . Las lecturas se alinearon casi exclusivamente con el genoma de L. fermentati , lo que confirma que no eran híbridos interespecíficos ( Figura complementaria S4 ).

Caracterización de levaduras

Prueba API de utilización, floculación y POF de azúcar

La prueba de utilización de azúcar API se realizó para investigar diferencias intraespecíficas. Los resultados se muestran en la Tabla 2 , junto con los resultados de la prueba de floculación y la prueba de sabor extraño fenólico.

TABLA 2

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Tabla 2. Prueba de utilización de azúcar API.

El patrón de utilización del azúcar mostró diferencias menores. Las cepas tipo CBS 707 y KBI 5.3 no mostraron crecimiento con ácido láctico como sustrato, mientras que KBI 1.2, KBI 3.2 y KBI 12.1 exhibieron un crecimiento débil. Sin embargo, Kurtzman et al. (2011) informaron un crecimiento positivo para CBS 707. El citrato férrico de esculina fue positivo para KBI 1.2, KBI 3.2 y KBI 12.1 y débil para CBS 707 y KBI 5.3. La reacción de color resultante de una reacción positiva al citrato férrico de esculina está asociada con la actividad de la β-glucosidasa ( Pérez et al., 2011 ). Sin embargo, la celobiosa, un azúcar ligado a β-1,4, no fue metabolizada por KBI 5.3 y solo débilmente por KBI 1.2 y KBI 5.3 a pesar de mostrar reacciones débiles o positivas al citrato férrico de esculina. En un estudio sobre las cepas de vino Lachancea fermentati ,Porter (2017) informó que de 10 cepas probadas, el 80% mostró actividad β-glucosidasa.

Según el ensayo de Helm modificado, CBS 707, KBI 3.2, KBI 5.3 y KBI 12.1 mostraron una floculación baja entre el 15 y el 28%, sin diferencia estadísticamente significativa ( p ≤ 0.05). KBI 1.2 mostró, con un 88%, el mayor comportamiento de floculación. La floculación de cepas de Lachancea fermentati también se ha informado en otros estudios y se demostró que su grado depende de la cepa ( Romano y Suzzi, 1993 ; Porter, 2017 ; Porter et al., 2019a ). Sin embargo, los ensayos de floculación de levadura como el ensayo de Helm pueden desviarse de las observaciones sobre el comportamiento de la floculación en la práctica y pueden ser difíciles de reproducir ( Stewart, 2018 ). En un estudio anterior de Bellut et al. (2019a), KBI 12.1 exhibió una alta floculación> 80%. De hecho, a partir de las observaciones durante las pruebas de fermentación en este estudio, KBI 12.1 muestra un comportamiento más floculante de lo que sugieren los resultados del ensayo de Helm aquí, con una floculación más comparable a la de la levadura de cerveza WLP001 como se informó anteriormente ( Bellut et al., 2019a ). Todas las cepas mostraron un comportamiento POF negativo.

Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Para visualizar las diferentes cepas de levadura e investigar las diferencias en la morfología celular, se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM). Las imágenes SEM de las cepas se pueden ver en la Figura 2 .

FIGURA 2

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Figura 2. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de las cepas de levadura (A) CBS 707, (B) KBI 1.2, (C) KBI 3.2, (D) KBI 5.3, (E) KBI 12.1 y (F) WLP001 en mismo aumento de × 3700. Tamaño de la barra horizontal: 5 μm.

El SEM confirmó diferencias inter e intraespecíficas en la morfología celular que se habían sospechado a partir de observaciones al microscopio óptico. Las células casi en forma de bastón del tipo de cepa CBS 707 eran más largas y delgadas que las otras cepas de Lachancea fermentati KBI. Las cicatrices de las yemas parecían estar ubicadas principalmente en o cerca de los extremos de la forma de barra. Las cepas KBI parecían tener una forma más redonda en comparación con la cepa tipo. KBI 12.1 pareció exhibir la mayor proporción de células de forma ovalada o esférica de las cepas de Lachancea fermentati , mientras que las células de WLP001 mostraron una forma esférica sustancialmente más pronunciada. En cuanto al tamaño de las células, las células de la levadura de cerveza eran más grandes en comparación con la Lachancea fermentati.células. El tamaño de la celda está relacionado con el área de superficie total de la celda, que determina las tasas de importación y exportación de nutrientes y productos de fermentación ( Michel et al., 2017 ). Por tanto, la diferencia en el tamaño de las células puede tener un fuerte efecto en el rendimiento de la fermentación y debe tenerse en cuenta al elegir las velocidades de lanzamiento.

Pruebas de esfuerzo

Durante la fermentación, las cepas de levadura aplicadas en la elaboración de cerveza deben lidiar con varios factores de estrés. Las concentraciones de iso-α-ácido de 100 y más mg / L ya no son una rareza [por ejemplo, las fuertes India Pale Ales (IPA)]. El etanol, otro factor de estrés, se acumula durante la fermentación, especialmente en la elaboración de cerveza de alta gravedad, que por sí solo implica otro factor de estrés: estrés osmótico (aquí simulado con sorbitol). Las cervezas agrias también están ganando popularidad y se requieren levaduras para fermentar mosto con un pH bajo y una alta concentración inicial de ácido láctico ( Peyer et al., 2017 ). Además, las cepas del género Lachancea pueden poseer la capacidad de producir cantidades significativas de ácido láctico durante la fermentación alcohólica. Las pruebas de estrés se realizaron para investigar las diferencias inter e intraespecíficas.La Tabla 3 muestra los resultados del crecimiento relativo en mosto en análisis de microtitulación en una instantánea a las 48 h después del lanzamiento con y sin el estresante en diferentes concentraciones.

TABLA 3

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Tabla 3. Crecimiento relativo en porcentaje en mosto después de 48 h con y sin estresante en diferentes concentraciones basadas en mediciones de DO 600 .

La concentración de iso-α-ácidos no influyó en el crecimiento de las cepas, lo que está de acuerdo con informes anteriores sobre varias especies distintas de Saccharomyces ( Bellut et al., 2018 ). Sin embargo, Michel et al. (2016) informaron que la presencia de 90 IBU afectaba las cepas de Torulaspora delbrueckii , lo que resultaba en una fase de retraso ligeramente prolongada y una pendiente ligeramente reducida de la curva de crecimiento.

Entre las cepas de L. fermentati , las cepas KBI exhibieron una mayor tolerancia hacia concentraciones más altas de etanol en el mosto en comparación con CBS 707, que mostró un deterioro del crecimiento pequeño pero significativo ya al 2.5% ABV, manifestándose como una disminución del crecimiento relativo del 10%. Con un 7,5% de ABV, CBS 707 mostró una inhibición del crecimiento casi total (5% de crecimiento relativo restante) mientras que las cepas KBI todavía mostraron un crecimiento relativo entre 53 y 71%. Con un ABV del 10% en el mosto, el crecimiento de CBS 707 y KBI 1.2 se inhibió por completo, mientras que KBI 3.2, KBI 5.3 y KBI 12.1 todavía mostraron poco crecimiento, entre 4 y 25%, siendo KBI 3.2 el más tolerante al etanol tensión. De acuerdo con Porter et al. (2019b) observó una inhibición total de L. fermentaticepa al 10% ABV durante una prueba de crecimiento en agar mientras todavía exhibía un crecimiento al 7% ABV. La levadura de cerveza WLP001 mostró una inhibición significativa al 5% de ABV con un 24% de crecimiento relativo disminuido. La inhibición total del crecimiento se alcanzó al 10% ABV. En general, WLP001 mostró una mayor sensibilidad hacia el etanol en comparación con las cepas KBI.

Durante el estrés osmótico, en presencia de altas concentraciones de sorbitol, las cepas de Lachancea fermentati mostraron un mayor deterioro del crecimiento en comparación con WLP001 con solo un crecimiento relativo restante del 26-41% a 200 g / L de sorbitol en comparación con el 70% de WLP001. Las diferencias intraespecíficas en la inhibición del crecimiento entre Lachancea fermentati fueron generalmente bajas, y CBS 707 mostró tentativamente una mayor sensibilidad.

En presencia de ácido láctico, todas las cepas de levadura fueron resistentes a concentraciones de hasta 16,3 mM (pH 3,5). Aunque estadísticamente significativo, el deterioro del crecimiento a concentraciones de ácido láctico entre 1,7 y 16,3 mM mostró ser muy bajo con una disminución máxima del crecimiento relativo del 5%. Sólo a concentraciones extremas de ácido láctico de 48,4 mM (pH 3), las cepas de L. fermentati mostraron un ligero deterioro del crecimiento del 13 al 17%, mientras que WLP001 mostró un deterioro del crecimiento del 47%.

Cuando se ajustó el pH del mosto con HCl, las cepas mostraron menos sensibilidad en comparación con el ajuste de pH con ácido láctico. Por ejemplo, a pH 3, WLP001 todavía exhibió un crecimiento del 85% en comparación con el 53% a pH 3 cuando se ajustó con ácido láctico. Sin embargo, a un pH de 2,5 e inferior, el crecimiento de WLP001 se inhibió por completo mientras que las cepas de L. fermentati todavía mostraban un crecimiento relativo entre 72 y 79%. La inhibición total del crecimiento de las cepas de L. fermentati se alcanzó a pH 2. Las diferencias intraespecíficas entre las cepas de Lachancea fermentati fueron pequeñas.

Las diferencias en el deterioro del crecimiento por los diferentes ácidos al mismo pH se pueden explicar con la propiedad química de los ácidos débiles. La presencia de un ácido débil como el ácido láctico conduce a un mayor estrés para la célula de levadura. Cuanto menor es el pH extracelular, más ácido láctico está presente en su forma protonada, especialmente a un pH por debajo del pK a del ácido respectivo (ácido láctico pK a : 3,86) y, por tanto, puede entrar en la célula por difusión pasiva. Dentro de la célula, a un pH intercelular más alto, el ácido láctico se desprotona. En consecuencia, la célula debe exportar tanto el protón como el anión, creando un ciclo que requiere energía. A altas concentraciones, este mecanismo puede conducir a la disipación de la fuerza motriz del protón, lo que conduce a la muerte celular ( Colombié et al., 2003 ;Sauer et al., 2010 ).

Susceptibilidad antifúngica

Si bien las especies de Candida son la causa principal de fungemia, se han informado casos de especies no patógenas como Saccharomyces cerevisiae que actúan como patógenos oportunistas en huéspedes inmunodeprimidos ( Cassone et al., 2003 ; Hamoud et al., 2011 ) y un caso de fungemia También se ha registrado la causa de Lachancea fermentati en un huésped inmunodeprimido ( Leuck et al., 2014 ). Además, dado que las especies de Lachancea son capaces de crecer a la temperatura del cuerpo humano (37 ° C) ( Kurtzman et al., 2011), es razonable investigar las posibles resistencias frente a los agentes antifúngicos. Etest probó la concentración mínima inhibitoria (MIC) de una variedad de agentes antifúngicos. Los resultados se muestran en la Tabla 4 . Todas las cepas demostraron ser susceptibles a todas las clases de agentes antifúngicos con solo pequeñas diferencias intraespecíficas e interespecíficas.

TABLA 4

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Tabla 4. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de agentes antifúngicos seleccionados después de 24 h de incubación.

Ensayos de fermentación

Fermentación del mosto

Se realizaron ensayos de fermentación para investigar el comportamiento de las cepas en términos de producción de etanol y ácido láctico y la concentración de subproductos de fermentación. El extracto de mosto secado por aspersión de la malta de cebada sirvió como sustrato para todas las fermentaciones. La Tabla 5 muestra los parámetros analíticos del mosto de fermentación incluyendo extracto, pH, nitrógeno amínico libre (FAN) y concentración de azúcar.

TABLA 5

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Tabla 5. Análisis del mosto de fermentación.

Análisis de muestras fermentadas

La fermentación se llevó a cabo hasta que no se pudo medir ningún cambio en el extracto durante dos días consecutivos. Para CBS 707, KBI 1.2, KBI 5.3 y WLP001, la atenuación final se alcanzó después de 11 días de fermentación a 25 ° C. KBI 3.2 y KBI 12.1 alcanzaron la atenuación final después de 13 días de fermentación. La Tabla 6 muestra los resultados analíticos de las pruebas de fermentación.

TABLA 6

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Tabla 6. Análisis de mosto fermentado.

Las cepas de L. fermentati alcanzaron atenuaciones finales de 70% e inferiores, debido a su incapacidad para consumir maltotriosa. KBI 12.1 exhibió, al 55%, la atenuación más baja. El análisis de azúcar reveló que KBI 12.1 solo había consumido el 76% de maltosa, mientras que las otras cepas la habían agotado al final de la fermentación. Solo WLP001 consumió maltotriosa, al 81%, mientras que las cepas de L. fermentati no consumieron maltotriosa. Al final de la fermentación, se detectaron valores de maltotriosa ligeramente superiores a los valores iniciales en algunos de los mostos fermentados con las cepas de L. fermentati . Todas las cepas consumieron glucosa y sacarosa por completo al final de la fermentación. En el mosto fermentado con CBS 707, quedó una pequeña cantidad de fructosa.

Las concentraciones de etanol se correlacionaron con la atenuación. La levadura de cerveza WLP001 exhibió la concentración más alta, con un 4,4% de ABV, seguida de cuatro de las cepas de L. fermentati con un 3,7% de ABV. KBI 12.1 produjo solo 3.0% ABV.

Las concentraciones de ácido láctico alcanzaron 0,94 mM en la muestra fermentada con WLP001. Li y Liu (2015) informaron valores similares producidos por una levadura lager, a 1.03 mM. Las levaduras Lachancea exhibieron valores finales de ácido láctico significativamente más altos. KBI 12.1 exhibió la concentración más alta de ácido láctico, a 3,47 mM, seguido por CBS 707, KBI 3.2, KBI 1.2 y KBI 5.3, a 2.41, 1.82, 1.55 y 1.33 mM, respectivamente. Sin embargo, estos valores todavía estaban por debajo del umbral de sabor informado del ácido láctico en la cerveza de 4,44 mM (400 mg / L) ( Siebert, 1999).

El consumo de FAN por las cepas L-fermentati fue relativamente bajo, con un 70 u 80% de la cantidad inicial restante al final de la fermentación. En comparación, WLP001 consumió la mitad de la cantidad de FAN en el mosto. El patrón de un bajo consumo de FAN de levaduras no Saccharomyces en comparación con las levaduras de cerveza se ha observado en estudios previos ( Estela-Escalante et al., 2016 ; Bellut et al., 2018 ). Se ha atribuido principalmente a una fermentación menos intensiva debido al consumo limitado de azúcar; sin embargo, en este estudio, la fermentación y el consumo de azúcar no difirieron en un grado que explicaría la absorción reducida de FAN, lo que sugiere una causa alternativa.

Cuando se detectaron, los valores de diacetilo estaban, a 0.02 mg / L, en o por debajo del umbral de sabor de 0.02–0.10 mg / L ( Meilgaard, 1975 ; Saison et al., 2009 ). Los valores de acetato de etilo fueron significativamente más altos en las cepas de L. fermentati en comparación con WLP001, hasta el doble de la concentración. Las concentraciones de acetato de 3-metilbutilo (acetato de isoamilo) fueron similares entre todas las cepas. Las concentraciones de acetato de 2-feniletilo fueron significativamente más altas en KBI 1.2, KBI 3.2 y KBI 12.1 en comparación con las otras cepas. CBS 707 produjo la mayor cantidad de alcoholes superiores, a 120 mg / L, y KBI 12.1 produjo la cantidad más baja, a 66 mg / L. figura 3ilustra las cantidades relativas de subproductos de fermentación volátiles producidos por las diferentes cepas de levadura. WLP001 produjo mayores cantidades de ésteres etílicos superiores (es decir, hexanoato de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo) mientras que CBS 707 produjo más alcoholes superiores en comparación con las otras cepas. Curiosamente, a pesar del aumento de la producción de ácido láctico por las cepas de Lachancea , las concentraciones de lactato de etilo fueron más altas en el mosto fermentado con WLP001. Ninguno de los subproductos volátiles de la fermentación se detectó en concentraciones superiores a sus umbrales de sabor individuales ( hoja de datos complementaria S1 ).

FIGURA 3

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Figura 3. Mapa de calor de la cantidad relativa de compuestos volátiles en los mostos fermentados. Se puede encontrar una tabla completa de compuestos relativos y cuantificados en la Hoja de datos complementarios S1 .

Optimización de la producción de ácido láctico con KBI 12.1

Si bien las cepas de L. fermentati produjeron cantidades significativamente mayores de ácido láctico en comparación con el control de S. cerevisiae , los valores todavía estaban por debajo del umbral de sabor informado para la cerveza de 4,44 mM (400 mg / L) ( Siebert, 1999 ). Por lo tanto, aplicamos RSM y realizamos una prueba en extracto de mosto con glucosa enriquecida para mejorar la producción de ácido láctico de la cepa KBI 12.1, que fue elegida como la mayor productora de ácido láctico de la selección ( Tabla 6 ).

Metodología de superficie de respuesta.

Las levaduras no Saccharomyces pueden requerir una tasa de lanzamiento significativamente más alta para mostrar un buen rendimiento de fermentación en comparación con la levadura de cerveza debido a su tamaño celular típicamente más pequeño. Un estudio de Michel et al. (2017) utilizando RSM para optimizar las condiciones de fermentación de una cepa de Torulaspora delbrueckii en mosto mostró que se logró una alta deseabilidad sensorial de la cerveza producida a una alta tasa de lanzamiento de 60 × 10 6 células / ml. Además, la temperatura de fermentación puede tener influencias significativas en la producción de subproductos de fermentación en todos los géneros de levadura, por ejemplo, una temperatura más alta que resulta en una mayor producción de ésteres ( Verstrepen et al., 2003 ; Michel et al., 2017 ;Tyrawa et al., 2019 ).

Para investigar las influencias de los parámetros de fermentación: velocidad de lanzamiento, temperatura y extracto de partida, en la producción de ácido láctico, se aplicó RSM. Se eligió un diseño compuesto central de tres factores, centrado en la cara, para investigar la producción de ácido láctico por KBI 12.1 en extracto de mosto en el rango de contenido de extracto entre 5 y 15 ° P, una tasa de lanzamiento entre 5 y 60 × 10 6 células / mL, y una temperatura de fermentación entre 16 y 28 ° C. El diseño detallado del experimento y las estadísticas del modelo se muestran en la hoja de datos complementaria S2 .

La Figura 4 muestra la superficie de respuesta como un modelo 3D de la producción de ácido láctico a 5, 10 y 15 ° P, en función de la temperatura de fermentación y la velocidad de lanzamiento.

FIGURA 4

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Figura 4. Modelo de superficie de respuesta 3D del factor de respuesta ácido láctico en función de la temperatura de fermentación y la velocidad de cabeceo a 5 ° P (A) , 10 ° P (B) y 15 ° P (C) . Detalles del modelo y estadísticas en la hoja de datos complementaria S2 .

El aumento del contenido de extracto mejoró el efecto de los parámetros de temperatura y velocidad de lanzamiento. Además, una baja tasa de lanzamiento tuvo un efecto positivo muy fuerte en la producción de ácido láctico. El ácido láctico también aumentó con el aumento de la temperatura de fermentación. La concentración más alta de ácido láctico alcanzada fue de 11,4 mM a una velocidad de lanzamiento de 5 × 10 6 células / ml y una temperatura de fermentación de 28 ° C. Se puede encontrar una tabla completa de los resultados de los factores de respuesta en la Hoja de datos complementarios S2 .

Prueba de glucosa agregada.

Para investigar la hipótesis de que la producción de ácido láctico puede potenciarse por la presencia de mayores cantidades de glucosa al comienzo de la fermentación, se llevó a cabo una prueba con una muestra de mosto enriquecida con glucosa. La Tabla 7 muestra los resultados analíticos de los tres mostos usados ​​en este ensayo antes y después de la fermentación con KBI 12.1.

TABLA 7

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Tabla 7. Análisis de mosto antes y después de la fermentación con KBI 12.1.

La adición de glucosa al mosto 7 ° P condujo a un aumento significativo en la concentración final de ácido láctico ( p <0.01) de 246%, de 5.2 a 18.0 mM, mientras que el contenido final de etanol de 2.6% ABV permaneció sin cambios ( Figura 5 ) . El pH de la muestra de mosto enriquecido con glucosa fue correspondientemente bajo, a 3,46. Por otro lado, aumentar el contenido de extracto de 7 a 10 ° P (sin la adición de glucosa) no tuvo influencia en la concentración final de ácido láctico ( p > 0.05) pero resultó en un contenido final de etanol significativamente mayor ( p < 0,001) ( Figura 5 ).

FIGURA 5

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Figura 5. Concentraciones finales de ácido láctico y etanol del extracto de mosto 7 ° P, extracto de mosto 7 ° P + glucosa al 3% y extracto de mosto 10 ° P después de la fermentación con KBI 12.1. ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001.

Los monosacáridos fructosa y glucosa se agotaron al final de la fermentación, mientras que la maltosa nunca se agotó por completo ( Tabla 7 ). Especialmente la muestra fermentada con glucosa enriquecida, que dio como resultado una alta producción de ácido láctico, exhibió altas concentraciones de maltosa residual al final de la fermentación, lo que es una indicación de una inhibición prematura por un pH bajo y / o una alta concentración de ácido láctico.

Prueba de elaboración de cerveza a escala piloto

Los resultados del experimento de optimización del ácido láctico proporcionaron información valiosa para el desarrollo del proceso de una prueba de elaboración de cerveza a escala. Los resultados de RSM indicaron que una baja velocidad de lanzamiento y una alta temperatura de fermentación son favorables para una mayor producción de ácido láctico, mientras que la prueba de glucosa enriquecida indicó que la producción de ácido láctico puede ser impulsada por la concentración inicial de glucosa del mosto. Teniendo en cuenta estos conocimientos, se añadió amiloglucosidasa durante el proceso de maceración de la producción de mosto para aumentar la cantidad de glucosa en relación con la maltosa. Al mismo tiempo, una baja tasa de cabeceo, a 5 × 10 6células / mL, junto con una temperatura de fermentación alta (25 ° C) se eligió para aumentar la producción de ácido láctico en el lado del proceso. El objetivo era crear una cerveza de bajo contenido alcohólico (LAB) deteniendo la fermentación prematuramente, en un punto en el que el ácido láctico producido esté en equilibrio con el dulzor de los azúcares residuales del mosto. Por ese motivo, se tomaron muestras cada 12 h hasta que se detuvo la fermentación mediante la filtración de la levadura mediante un filtro de placas. La Figura 6 ilustra el progreso de la fermentación, así como los resultados del análisis de subproductos volátiles de la fermentación y la evaluación sensorial del LAB producido (36 h).

FIGURA 6

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Figura 6. Análisis de fermentación (A) a escala piloto (60 L ) de cerveza de bajo contenido alcohólico con KBI 12.1. Los subproductos de fermentación (B) y los datos sensoriales (C) de la cerveza de bajo contenido alcohólico corresponden a los datos de fermentación a las 36 h (cerveza de bajo contenido alcohólico terminada). Los valores a las 216 h muestran la cerveza en la atenuación final alcanzada sin la interrupción de la fermentación.

La concentración de etanol de la cerveza en la interrupción de la fermentación después de 36 h había alcanzado el 1,26% ABV. La concentración de ácido láctico alcanzó 13,6 mM (= 1,23 g / L) a un pH final de 3,56. El extracto aparente final de LAB fue 6.23 ° P. El recuento celular mostró un crecimiento constante en las primeras 24 h, después de lo cual disminuyó a una concentración celular en el momento de la filtración de 43 × 10 6células / mL. La glucosa se agotó por completo después de 36 h de fermentación, mientras que permanecieron 0,17 mM (0,24 g / L) de fructosa. La maltosa solo vio una pequeña disminución y la maltotriosa se dejó intacta. El análisis de la cerveza que se dejó en el fermentador para alcanzar la atenuación final (216 h) mostró solo un pequeño aumento adicional en el ácido láctico a una concentración de 16,1 mM, mientras que se duplicó la concentración de etanol hasta un valor final de 2,57% ABV. En la atenuación final, solo se consumió aproximadamente el 55% de la maltosa, sin cambios en las concentraciones de maltotriosa. El análisis de los subproductos volátiles de la fermentación del LAB de fermentación detenida reveló una baja concentración de éster de 6,5 mg / L ( Figura 6B ). A 0,27 mg / L, el valor de diacetilo estaba también por encima de su umbral de sabor de 0,02 a 0,10 mg / L ( Meilgaard, 1975 ;Saison et al., 2009 ). El diacetilo, un compuesto de sabor mantecoso no deseado, es un subproducto de la fermentación que, al final de la fermentación, a menudo se encuentra en concentraciones superiores a su umbral de sabor. En ese caso, se aplica un resto de diacetilo para permitir que la levadura reduzca el diacetilo a concentraciones por debajo del umbral de sabor. En este estudio, la levadura se separó de la cerveza joven antes de que se alcanzara la atenuación final y, por lo tanto, no fue posible la reducción de la concentración de diacetilo.

Los resultados de la evaluación sensorial indicaron que se alcanzó una relación equilibrada entre el dulzor residual de maltosa y maltotriosa y la acidez del ácido láctico ( Figura 6C ). El cincuenta por ciento (rango intercuartílico IQR; 50% de los valores totales reportados) de los panelistas calificaron la relación dulzura / acidez entre 4.2 y 6.0 en una escala de 0 a diez, con 0 "demasiado dulce", 5 "justo" y 10 "Demasiado amargo". Los valores correspondieron a azúcares residuales de 17.0 mM (12.4 g / L) de maltosa, 6.2 mM (3.1 g / L) de maltotriosa y 0.17 mM (0.24 g / L) de fructosa y una concentración de ácido láctico de 13.6 mM (1.23 g / L) . La frutosidad se calificó de media a alta con un IQR que variaba de 5 a 7 de 10. La aceptabilidad general se calificó con un IQR que variaba de 6.5 a 9.0 de 10.

Discusión

En este estudio, investigamos cuatro cepas de Lachancea fermentati aisladas de kombucha. El análisis del genoma se realizó para obtener conocimientos fundamentales, dilucidar las diferencias intraespecíficas debido a su origen y en un intento de vincular los genotipos de las cepas con su fenotipo en las fermentaciones de mosto. Las cepas se caracterizaron por, por ejemplo, su utilización de azúcar y sensibilidades al estrés para evaluar su idoneidad en la elaboración de cerveza. Se realizó un cribado en el mosto para investigar las diferencias intraespecíficas y determinar el mejor productor de ácido láctico. Posteriormente, se investigaron los parámetros de fermentación temperatura, velocidad de lanzamiento y concentración de glucosa para mejorar la producción de ácido láctico. Finalmente, se produjo una cerveza de bajo contenido alcohólico a escala piloto en condiciones optimizadas.

Los resultados del análisis del genoma mostraron que los cuatro aislados de kombucha eran diversos y generalmente separados en dos grupos, en relación con su origen. Los aislados diploides KBI 1.2, KBI 3.2 y KBI 12.1 exhibieron una alta heterocigosidad, una indicación de híbridos intraespecíficos. Potencialmente, los aislamientos comparten un ancestro común basado en patrones en LOH. Esta hipótesis está respaldada por el origen geográficamente cercano de KBI 1.2 y KBI 3.2, Estados Unidos. Debido al origen geográfico remoto de KBI 12.1 (Hawái), su estrecha relación filogenética con KBI 1.2 y KBI 3.2, en contraste con KBI 5.3, requiere la suposición de que se ha producido un intercambio de culturas de kombucha entre los Estados Unidos limítrofes y Hawái. en algún momento. De hecho, el intercambio de culturas de kombucha entre cerveceros de kombucha,The New York Times, 2010 ). A diferencia de los aislados de los Estados Unidos, KBI 5.3, que se origina en Australia, mostró una relación filogenética más estrecha con CBS 6772, que se origina en Corea del Sur, y CBS 707, cuyo país de origen se desconoce. Desafortunadamente, hasta la fecha, se dispone de datos de secuencia muy limitados para la comparación.

En general, en comparación con la especie Saccharomyces cerevisiae ampliamente estudiada , la especie L. fermentati o incluso el género Lachancea no se ha investigado a fondo. En consecuencia, solo con la suposición inicial de un fuerte grado de homología entre las especies de levadura, se pueden hacer suposiciones sobre el metabolismo de Lachancea fermentati .

La mayor resistencia a las condiciones de pH bajo de las cepas de Lachancea , en comparación con la levadura de cerveza durante la prueba de estrés, podría tentativamente estar relacionada con su tendencia a producir cantidades significativas de ácido láctico durante la fermentación alcohólica. Las cepas deben exportar constantemente lactato y H + fuera de la célula para mantener la fuerza motriz del protón y, por esta razón, pueden estar preadaptadas a altas concentraciones de iones H + . Además, es probable que el ambiente ácido de la kombucha también se haya seleccionado para cepas con mayor tolerancia a altas concentraciones de ácido y bajos valores de pH ( Chakravorty et al., 2016 ).

Además de obtener conocimientos fundamentales sobre las características de las cepas, nuestro objetivo era optimizar la producción de ácido láctico por L. fermentati durante la fermentación. Los valores observados de producción de ácido láctico (entre 1,33 y 3,47 mM) en el extracto de mosto de las cepas de L. fermentati investigadas fueron bajos en comparación con los valores informados anteriormente. Osburn y col. (2018) informaron la producción de ácido láctico de 10 mM por una cepa de L. fermentati en un mosto de 11,4 ° P a una tasa de lanzamiento de aproximadamente 5 × 10 6 células / ml y 21,7 ° C. En un estudio previo con KBI 12.1, Bellut et al. (2019a) informó la producción de 14,4 mM de ácido láctico en un mosto de 6,6 ° P a una tasa de lanzamiento de 8 × 10 6células / mL y 25 ° C. Sin embargo, los estudios antes mencionados utilizaron diferentes condiciones de fermentación (por ejemplo, velocidad de lanzamiento, temperatura) y sustratos, lo que tiene una influencia significativa en la producción de ácido láctico, como hemos demostrado en este estudio. Bellut y col. (2019b) ya informaron diferencias significativas en la producción de ácido láctico por KBI 12.1 en diferentes sustratos de cereales, pseudocereales y legumbres que no se pudieron rastrear hasta el espectro del azúcar o el espectro de aminoácidos libres, lo que subraya aún más el escaso conocimiento sobre los factores que modulan producción de ácido láctico en Lachancea fermentati .

Se realizó la secuenciación del genoma completo para conectar las observaciones del fenotipo con el genotipo de las cepas individuales. KBI 5.3 portaba una mutación (397C> T) en el gen LAFE_0A07888G, lo que resultó en un codón de parada prematuro (Gln133 ∗ ) ( Hoja de datos complementaria S1 ). LAFE_0A07888G es un gen con alta similitud con el gen JEN1 en S. cerevisiae . JEN1 codifica el transportador de monocarboxilato Jen1 que demostró ser un exportador de ácido láctico ( Casal et al., 1999 ), mejorando el rendimiento de ácido láctico en cepas de S. cerevisiae transformadas con deshidrogenasas bacterianas del ácido láctico ( Branduardi et al., 2006 ; Pacheco et al., 2012). La mutación sin sentido en el homólogo JEN1 de KBI 5.3 podría haber sido tentativamente la razón de la producción de ácido láctico significativamente baja en comparación con las otras cepas de L. fermentati . Sin embargo, además de Jen1p, existe al menos otro transportador de ácido láctico ( Pacheco et al., 2012 ), que podría explicar tentativamente la producción restante, aunque baja, de ácido láctico. Además, también se observó una deleción de un solo nucleótido (230delT) en LAFE_0E15192G en la cepa KBI 5.3 ( hoja de datos complementaria S1 ). LAFE_0E15192G muestra algunas similitudes con S. cerevisiae YML054C CYB2, un componente del citocromo b2 (L-lactato citocromo-c oxidorreductasa) del espacio intermembrana mitocondrial que se requiere para la utilización del lactato (y reprimido por la glucosa y las condiciones anaeróbicas) ( Sauer et al., 2010 ). Esta mutación de cambio de marco podría explicar tentativamente la incapacidad de crecer en ácido láctico como único sustrato en la prueba API. Sin embargo, estos efectos deberían probarse en estudios futuros mediante ingeniería inversa.

Los resultados de RSM han demostrado que para impulsar la producción de ácido láctico, se debe usar una tasa de lanzamiento baja en combinación con una temperatura de fermentación alta. Además, en las condiciones favorables, un extracto inicial más alto condujo a concentraciones más altas de ácido láctico. Se sugirió que el hecho de que las muestras con alta producción de ácido láctico no alcanzaran la atenuación final ( hoja de datos complementaria S2 ) se debía a la inhibición del producto final a través del mecanismo descrito en la sección Pruebas de estrés. Combinado con el conocimiento de que la glucosa se absorbe comúnmente al comienzo de la fermentación antes de que se consuman grandes cantidades de maltosa, sacarosa o maltotriosa ( Horák, 2013), se planteó la hipótesis de que el aumento de la producción de ácido láctico en los mostos con mayor contenido de extracto durante el ensayo RSM se atribuyó a una mayor cantidad de glucosa. Los resultados de la prueba con glucosa enriquecida indicaron que la producción de ácido láctico por KBI 12.1 puede de hecho ser modulada por la cantidad de glucosa presente al comienzo de la fermentación. Dentro del rango investigado de 7–10 ° P, una mayor cantidad de glucosa resultó en una mayor producción de ácido láctico, pero sin una mayor producción de etanol.

La optimización de RSM y la prueba de glucosa agregada han demostrado que la producción de ácido láctico por KBI 12.1 depende en gran medida de la velocidad de lanzamiento, la temperatura de fermentación y la concentración inicial de glucosa. La producción de ácido láctico por la cepa KBI 12.1 varió de 0,5 a 18,0 mM según las condiciones de fermentación y la composición del sustrato. Se demostró que, para aumentar la producción de ácido láctico por Lachancea fermentati KBI 12.1 en el mosto, la concentración de glucosa debe ser lo más alta posible, la tasa de lanzamiento baja (5 × 10 6 células / mL) y la temperatura de fermentación alta (≥ 25 ° C).

La alta producción de ácido láctico en muestras con una tasa de lanzamiento baja sugiere que la producción de ácido láctico tuvo lugar principalmente durante la fase de crecimiento al comienzo de la fermentación. Por el contrario, en las mismas condiciones, pero a altas velocidades de lanzamiento, se produjo poco ácido láctico. Esta hipótesis fue apoyada por los datos de fermentación de la prueba de elaboración de cerveza ampliada, donde el 84% del ácido láctico total ya se produjo en las primeras 36 h de fermentación, mientras que las células en suspensión crecieron de 5 a 43 × 10 6 células / ml. Sin embargo, en el caso de la fermentación escalonada, la producción de ácido láctico también se correlacionó con el consumo y el agotamiento de glucosa.

A nivel molecular, la metabolización del piruvato a través del ácido láctico deshidrogenasa es un medio adicional de reciclaje de NADH, siendo la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa las vías más comunes. El NADH se produce durante la glucólisis, la vía generadora de ATP de las levaduras en condiciones anaeróbicas, y debe reciclarse a NAD + ( Figura 7 ). Sin embargo, mientras que el etanol puede salir de la célula por difusión pasiva, el ácido láctico tiene que ser transportado activamente fuera de la célula a expensas del ATP. Esto se debe al hecho de que a un pH intracelular elevado, el ácido láctico se disocia en lactato y un protón. Para mantener la fuerza motriz del protón y el pH intracelular, este protón debe exportarse a través de la membrana plasmática H +-ATPasa, con el gasto de un ATP por protón. En el peor de los casos, la exportación de lactato también depende de ATP, aunque aún se desconocen los mecanismos exactos ( Maris et al., 2004 ; Abbott et al., 2009 ; Mans et al., 2017 ). Abbott y col. (2009) confirmaron que la exportación de ácido láctico requiere energía en forma de ATP, lo que se demostró por un agotamiento total de ATP durante la fermentación de homolactato anaeróbico con una cepa de S. cerevisiae . Fuera de la célula, a un pH extracelular bajo, el ácido láctico vuelve a estar presente en su forma protonada y, por lo tanto, puede penetrar la membrana celular a través de la difusión pasiva, creando un ciclo que requiere energía ( Sauer et al., 2010).). La evidencia disponible sugiere, por tanto, que el reciclaje de NADH a través de la vía del ácido láctico parece ser más caro para la célula que la vía del etanol. Aún se desconoce por qué se elige la vía del ácido láctico en primer lugar, al menos al comienzo de la fermentación, y destaca la necesidad de más investigación en esta área. Presumiblemente, el reciclaje simultáneo de NADH a través de la vía del ácido láctico y el etanol, que resulta en una acumulación de ácido láctico, se desarrolló como una estrategia para competir con otros microbios, comparable a la estrategia de "hacer-acumular-consumir" para el etanol en S. cerevisiae ( Piškur et al., 2006 ; Pfeiffer y Morley, 2014 ). En un estudio sobre S. cerevisiae , Pacheco et al. (2012) encontraron que cuando la glucosa está presente, el ácido láctico producido se exporta fuera de la célula a través de Jen1 y Ady2, pero cuando la glucosa (que actúa como la única fuente de carbono) se agota, los transportadores también participan activamente en el consumo de ácido láctico.

FIGURA 7

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Figura 7. Ilustración simplificada de los mecanismos celulares implicados en la producción de ácido láctico y la autoinhibición en Lachancea fermentati en fermentaciones de mosto anaeróbico bajo el supuesto de homología fundamental con Saccharomyces cerevisiae . Adaptado de Sauer et al. (2010) y Bellut et al. (2019a) . (1) Transporte de glucosa al interior de la célula mediante difusión facilitada. El rendimiento neto de ATP por molécula de glucosa es 2. (2) Glucólisis, que produce una molécula de ATP por molécula de piruvato formado y una molécula de NADH que debe reciclarse a NAD + . (3)Producción de etanol vía piruvato descarboxilasa (PDC) y alcohol deshidrogenasa (ADH). El etanol puede salir de la célula por difusión pasiva. (4) Producción de ácido láctico vía ácido láctico deshidrogenasa (LDH). A un pH intracelular elevado, el ácido láctico se disocia en lactato y H + . (5) Tanto la formación de etanol como la formación de ácido láctico son un medio para reciclar NADH a NAD + . (6) Como mínimo, el H + debe exportarse fuera de la célula a expensas de una molécula de ATP. En el peor de los casos, los mecanismos dependientes de ATP pueden estar involucrados en la exportación de protones y aniones ( Abbott et al., 2009 ; Mans et al., 2017 ). (7)A un pH extracelular bajo, el ácido láctico está presente en su forma protonada y puede ingresar a la célula nuevamente a través de la difusión pasiva, creando un ciclo que requiere energía con 6 . (8) El transporte de maltosa al interior de la célula se facilita mediante el simportador de protones. En consecuencia, el protón debe exportarse fuera de la célula a expensas del ATP. Por esa razón, el rendimiento neto de ATP por molécula de glucosa de la maltosa es de 1,5 en lugar de 2.

Existe un consenso general de que todos los sistemas de transporte de maltosa en S. cerevisiae caracterizados hasta ahora median el transporte hacia las células de levadura contra un gradiente de concentración en simportación con protones. Esta importación de protones se equilibra con la exportación de protones a través de la H + -ATPasa de la membrana plasmática , a expensas de un ATP por protón. Esto significa que la absorción de una molécula de maltosa se produce a expensas de una molécula de ATP ( De Kok et al., 2012). En consecuencia, mientras que la glucosa ingresa a la célula a través de la difusión facilitada, la maltosa debe importarse activamente a la célula a través del simportador de protones. La consiguiente exportación del protón a expensas del ATP reduce el rendimiento neto de ATP de maltosa a 1,5 ATP por molécula de glucosa, en lugar de 2 ATP por molécula de glucosa que ingresaron a la célula a través de la difusión facilitada. La Figura 7 ilustra los mecanismos celulares simplificados implicados en la producción de ácido láctico y el mantenimiento de la fuerza motriz del protón en Lachancea fermentati en fermentaciones de mosto anaeróbico asumiendo una homología fundamental con S. cerevisiae .

Los resultados de este estudio indican que al comienzo de la fermentación, a pH relativamente alto, baja concentración de ácido láctico y presencia de glucosa, L. fermentati KBI 12.1 puede permitirse reciclar simultáneamente NADH a través de la vía del ácido láctico. Un cambio hacia la vía del etanol como el único medio de reciclaje de NADH pareció ocurrir una vez que se agotó la glucosa y el mantenimiento de la fuerza motriz del protón se volvió más costoso debido a un rendimiento neto reducido de ATP de la maltosa en comparación con la glucosa, combinado con un estrés creciente causado por un aumento concentraciones de ácido láctico ( Figura 7 ). Sin embargo, aunque nuestros resultados dan las primeras indicaciones sobre los mecanismos subyacentes para la modulación de la producción de ácido láctico en L. fermentatien las fermentaciones de mosto, es necesaria más investigación sobre la utilización de ATP y el equilibrio redox para sacar conclusiones.

Fue posible crear una cerveza de bajo contenido alcohólico (1,26% ABV) con KBI 12.1 interrumpiendo la fermentación después de 36 h. Los panelistas evaluaron la relación entre el dulzor residual y la acidez causada por el ácido láctico como equilibrada, lo que proporciona una buena indicación para futuras aplicaciones. Sin embargo, al eliminar la levadura del mosto prematuramente, quedaron cantidades significativas de diacetilo en la cerveza joven, lo que puede afectar negativamente el sabor de la cerveza, lo que limita el uso de esta cepa para la fermentación detenida. La alta concentración de diacetilo podría potencialmente abordarse después de la fermentación con un tratamiento enzimático mediante α-acetolactato descarboxilasa inmovilizada ( Krogerus y Gibson, 2013 ). En un estudio anterior, Bellut et al. (2019a)produjo una cerveza de bajo contenido alcohólico con KBI 12.1 a partir de un mosto de 6.6 ° P. Sin embargo, la concentración de etanol fue, al 2,6% ABV, considerablemente más alta después de que se alcanzó la atenuación final, en comparación con el 1,26% ABV después de la interrupción de la fermentación en este estudio. Debido al consumo de todos los azúcares fermentables y una alta producción de ácido láctico (14,4 mM), el sabor de la cerveza también se caracterizó como ácido. Sin embargo, el diacetilo estaba por debajo de su umbral de sabor ya que la fermentación se detuvo de forma natural.

Conclusión

Para concluir, mientras que los mecanismos exactos para la producción de ácido láctico en Lachancea fermentatisiguen siendo desconocidos, hemos dilucidado los factores que influyen y pudimos arrojar algo de luz sobre el comportamiento de la cepa KBI 12.1 en las fermentaciones de mosto con respecto a una producción mejorada de ácido láctico y su consiguiente inducción de una inhibición prematura de la fermentación. Demostramos que la cepa puede permitirse la producción de ácido láctico costosa en energía hasta que se alcanza una concentración alta (aquí hasta 18 mM) solo mientras haya glucosa presente en el mosto. Se podría producir una cerveza con bajo contenido de alcohol que tuviera un perfil equilibrado entre el dulzor de los azúcares residuales y la acidez del ácido láctico producido. Sin embargo, debido al cese prematuro de la fermentación, el diacetilo estaba presente por encima de su umbral de sabor. Los ensayos de aplicación futuros deberían centrarse en encontrar el valor de extracto ideal y el espectro de azúcar ideal del mosto para facilitar altas concentraciones de ácido láctico en equilibrio con el dulzor residual y, al mismo tiempo, alcanzar la atenuación final. Validar la hipótesis de la influencia de los mutadosGenes similares a JEN1 y CYB2 en KBI 5.3 que conducen a una producción reducida de ácido láctico, los experimentos de eliminación de genes en las cepas sin la mutación podrían conducir a más conocimientos sobre la modulación de la producción de ácido láctico en Lachancea fermentati .

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados para este estudio se pueden encontrar en las lecturas de Illumina generadas en este estudio que se han enviado a NCBI-SRA con el número de BioProyecto PRJNA587400 en la base de datos de BioProyecto de NCBI.

Declaración de Ética

Se requirió aprobación ética para este estudio de acuerdo con las pautas locales. El ensayo sensorial se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices de IFST para las prácticas éticas y profesionales para el análisis sensorial de los alimentos y el panel proporcionó su consentimiento informado por escrito para participar en la investigación.

Contribuciones de autor

KB realizó los experimentos de fermentación, análisis y estadísticas descritos en este estudio. KK realizó citometría de flujo y análisis bioinformático de todos los datos de la secuencia del genoma. KB, KK y EA diseñaron los experimentos. KB y KK escribieron el manuscrito. EA supervisó este estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Fondos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo Baillet Latour en el marco de una beca para estudiantes de doctorado.

Conflicto de intereses

KK fue contratado por VTT Technical Research Center of Finland Ltd.

Los autores restantes declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

El editor responsable declaró una coautoría pasada con uno de los autores KK.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a Andrea Hoehnel por su ayuda con respecto a los análisis de HPLC, a Jonas Atzler por su ayuda con la microscopía electrónica de barrido, a Josh Taylor y al Kerry Group por la amable donación de la enzima utilizada en este estudio, y a Brian Gibson, David De Schutter y Luk Daenen por la lectura crítica del manuscrito.

Material suplementario

El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.00764/full#supplementary-material

Notas al pie

^ http://gryc.inra.fr

^ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

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Palabras clave : elaboración de cerveza, fermentación, kombucha, Lachancea fermentati , ácido láctico, NABLAB, metodología de superficie de respuesta, secuenciación del genoma completo

Cita: Bellut K, Krogerus K y Arendt EK (2020) Lachancea fermentati Strains Isolated From Kombucha: Fundamental Insights, and Practical Application in Low Alcohol Beer Brewing. Parte delantera. Microbiol.11: 764. doi: 10.3389 / fmicb.2020.00764

Recibido: 20 de enero de 2020; Aprobado: 30 de marzo de 2020;

Publicado: 23 de abril de 2020.

Editado por:

Francisco A. Cubillos, Universidad de Santiago de Chile, Chile

Revisado por:

Diego Libkind, CONICET Instituto Andino Patagónico en Tecnologías Biológicas y Geoambientales (IPATEC), Argentina

Diego Bonatto, Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil

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* Correspondencia: Elke K. Arendt, e.arendt@ucc.ie

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.00764/full