La etimología de la palabra fermentación procede del latín "fervere", que literalmente significa hervir, queriendo expresar en el proceso de transformación del mosto en vino, el fenómeno espontáneo de subida de temperatura y desprendimiento de gas carbónico, aparentemente similar al producido por el agua cuando hierve o "fervor", al someterla a un fuerte calentamiento. En la antigüedad parecía inexplicable y algo mágico, que un líquido azucarado como es el mosto, se transformase de manera espontánea en otro líquido distinto, el vino, logrando una bebida que poseía propiedades sensoriales agradables y también euforizantes.
Las teorías sobre esta transformación, llamada "fermentación" por ignorancia del exacto proceso, fueron múltiples e incluso por su misterio, formaron durante cientos de años parte de la Alquimia; pero los avances de las Ciencias en los últimos siglos, desvelaron el secreto de este singular fenómeno. El holandés Van Leeuwenhoek (1680) inventó el primer microscopio y observó en la cerveza fermentada unos pequeños corpúsculos ovalados, que los llamó "animáculas", responsables probablemente del fenómeno de la fermentación. Sin embargo este descubrimiento quedó en el olvido, hasta que a finales del siglo XVII, el científico francés Lavoisier, emitió la primera hipótesis de la fermentación, conocida como la teoría mecánica, donde se desarrolla la primera ecuación de la transformación del mosto en vino:
Mosto de uva = Anhídrido carbónico + Alcohol
Más adelante Gay-Lussac (1813) representó el proceso fermentativo con la siguiente expresión:
C6H1206 --> 2CH3 - CH2OH +2C02Algo más tarde entre los años 1835 a 1837, tres investigadores: Caignard Latour, Kützing y Schwann formulan en la fermentación la teoría vitalista, donde rescatan las observaciones de Van Leeuwenhoek, y explican este fenómeno por intervención de seres vivos microscópicos y pertenecientes al reino vegetal. El último denomina a los microorganismos de la cerveza como "zuckerpilz" que significa "hongo del azúcar", y que incluso Meyen en 1838 clasifica como Saccharomyces, siendo más tarde conocidas como "levaduras" cuyo término procede de "levare" o levantar.
Sin embargo, en contra del concepto vitalista muy en boga en aquellos tiempos, otro grupo de científicos como Wohler, Liebig y Berzelius entre otros, niegan la intervención de los seres vivos, aunque reconocen su presencia en los medios fermentativos, y desarrollan una teoría química, donde las transformaciones se producían por reacciones meramente químicas, debidas a la acción catalítica de las levaduras, pero sin participar directamente en el proceso.
El genio Louis Pasteur demostró en 1866 de manera irrefutable, la naturaleza biológica de las fermentaciones, desmontando la teoría de la "generación espontánea", y explicando que sin la presencia de microbios o gérmenes específicos, no se podía producir una fermentación. Curiosamente Pasteur inició sus investigaciones microbiológicas con el vino, para luego terminar con las enfermedades infecciosas humanas. No es de extrañar el cariño y el aprecio que tenía por el vino, llegando a definirlo como "la más sanas de las bebidas"; devoción que las personas que desde entonces integran la comunidad vitivinícola le devuelven, considerándolo como uno de los padres de esta ciencia y cultura.
En 1858 Traube había anticipado la hipótesis de que la levadura degrada el azúcar, gracias a un "principio activo", que más tarde se conocería como "enzima", llegando incluso Pasteur a buscarlo sin encontarlo, bajo el nombre de "alcoholasa". Después de la muerte de Pasteur, los hermanos Buchner en 1896, logran separar la enzima de la fermentación de las levaduras, obteniendo la prueba de la naturaleza enzimática de las fermentaciones, llamando a esta sustancia como "zimasa alcohólica".
Además de las levaduras, las uvas, mostos y vinos pueden contener otros microorganismos, como son los mohos, bacterias lácticas y acéticas; cuya presencia en éstos es inevitable, y que cuando se desarrollan pueden ocasionar graves alteraciones en los vinos, salvo en el caso de la "fermentación maloláctica" que está considerada en algunos casos como una transformación beneficiosa.
TAXONOMÍA DE LAS LEVADURAS
Haeckel (1866) y Hansen (1881) dividieron el mundo de los seres vivos en tres reinos: vegetal, animal y protistas, subdividiéndose estos últimos en protistas procariotas o protistas inferiores, que comprenden todas las bacterias y algunos grupos de algas, y los protistas eucariotas o protistas superiores, que contienen los protozoos, la mayoría de las algas, y los hongos, estando dentro de estos últimos las levaduras.
Durante el siglo XX se han sucedido diversas clasificaciones de levaduras, debidas a autores como Lodder y Kreger Von Rij (1952), Lodder (1970), Kreger y Von Rij (1984), Kurtzman y Fell (1998) en sus respectivas ediciones correspondientes a "The yeast. A taxonomic study" y a otros como Bamett y col. (1983,1990, 2000) autores de la obra "Yeast: characteristics and identification", agruparon y separaron las distintas levaduras, pudiendo actualizarse en las vendimias o los vinos de acuerdo con el siguiente criterio. Las levaduras son definidas como hongos unicelulares microscópicos, que se reproducen por gemación o escisión, constituyendo un grupo taxonómico complejo y heterogéneo, que incluye actinomicetos y basidiomicetos. La unidad más importante en la taxonomía de las levaduras es la especie, y se define como un conjunto de cepas que comparten numerosas propiedades estables, pero que difieren de forma significativa de otro propio de cepas distintas.
Ascomicetos:
- Familia Schizosaccharomycetaceae: Género Schizosaccharomyces.
- Familia Metschnikowiaceae: Género Metschnikowia.
- Familia Saccharomycetaceae: Géneros Saccharomyces, Debaryomyces, Dekkera, Kluyveromyces, Pichia, Zygosaccharomyces y Torulaspora.
- Familia Saccharomycodaceae: Géneros Hanseniaspora y Saccharomycodes.
- Familia Candidaceae: Géneros Brettanomyces, Candida y Kloeckera.
Basidiomicetos:
- Familia Sporobolomycetacea: Género Rhodotorula.
- Familia Cryptococcaceae: Género Cryptococcus.
Considerando únicamente a las levaduras del género Saccharomyces, la evolución de nomenclatura en los últimos años, según autores en los mencionados autores, ha sido la siguiente:
Los primeros métodos para la identificación y por lo tanto clasificación de las levaduras, se basaron en el estudio de caracteres morfológicos, tales como el estudio de la forma, de sus dimensiones celulares, y de la formación de esporas. También se aplicaron criterios fisiológicos entre los que destacan las características culturales, las propiedades fermentativas de azúcares y de asimilación de compuestos carbonados y nitrogenados, así como la necesidad de factores de crecimiento. Pero estos criterios fenotípicos no han sido en ocasiones suficientes, para establecer con claridad una correcta clasificación y delimitación de las especies de levaduras, por lo que a partir de los años ochenta del siglo pasado, el avance de la genética y de la tecnología molecular, han permitido utilizar diversas técnicas de análisis del ADN, que deberán complementarse con las anteriores, y entre las que destacan:
- Similitud en la composición de bases del ADN (% mol G + C).
- Porcentaje de homología ADN-ADN.
- Análisis de restricción del ADN genómico o mitocondrial (RFLP).
- Análisis de cariotipos cromosómicos por electroforesis en campo pulsado.
- Análisis por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) mediante la amplificación al agar del ADN polimorfico (RAPDs); la amplificación de secuencias del genoma entre elementos d o elementos Ty; la amplificación de microsatélites o secuencias simples repetidas presentes en el ADN genómico; o la amplificación y posterior restricción enzimática de zonas ITS1-5,8S-ITS2 del ADN ribosómico (rADN). ITS: internai transcriber spacer.
Descripción de las principales levaduras vínicas:
Las dimensiones de las levaduras se sitúan entre unos límites bastante amplios, desde 1 a 5 mm de anchura, por 1 a 28 mm de longitud, estimándose en un mosto en fermentación que desarrollan una superficie del orden de 10 a 15 m2 por cada litro de mosto. En cuanto a su forma, ésta suele permanecer bastante constante para cada especie, tomando un aspecto característico y bien definido, dependiendo también del tipo de reproducción: subesférico o elíptico (Saccha- romyces cerevisiae), alargado (Saccharomyces pastorianus), mucronado o limoniforme (Kloeckera apiculata), bacilar (Schizosaccharomyces), cilindrico (Candida mycoderma), redondeado (Torulopsis), etc.
Siguiendo las descripciones realizadas por J.Ribéreau-Gayon, Tarantola, F. Oreglia, y Kurtzman y Fell, las levaduras vínicas más importantes presentan las siguientes características.
- Género Brettanomyces (Kutterth y Von Laer): Levaduras de multiplicación muy lenta en el mosto. Células de forma esferoidal ligeramente alargada, frecuentemente ojival, con unas dimensiones de (2 a 7) x (3 a 28) fim, presentándose aisladas o por parejas e incluso en cadenas de hasta cuatro o cinco unidades. Pueden formar velos en la superficie de los vinos de mayor o menor espesor. Multiplicadas en medios de cultivo, toman una forma más redondeada, con un aspecto de color crema, húmedo y brillante.
Los caracteres enológicos de estas levaduras son negativos, por lo que son consideradas como causantes de alteraciones. Por una parte, se percibe un aroma ligeramente afrutado a manzana, con marcados matices a acetato de etilo, y por otra parte aparece un característico olor defectuoso a "sudor de caballo" o de tipo animal. Este olor se debe a una transformación de los ácidos cinámicos del vino, de carácter inodoro, en otras sustancias conocidas como etilfenoles, que presentan estos aromas fenolados defectuosos.
Esta alteración puede producirse en el seno del vino, pero generalmente se produce en vinos mal conservados, donde se desarrolla en su superficie un velo de Brettanomyces, y especialmente en la crianza de vinos en barrica. La forma esporógena de las Brettanomyces recibe el nombre de Dekkera (Von der Walt).
- Género Candida (Berkhout): En los vinos pueden encontrarse numerosas especies, destacando entre ellas la Candida vini antiguamente llamada Candida mycoderma. En medio líquido se forma rápidamente en su superficie un velo de aspecto seco y rizado, de color blanquecino o amarillento, que cuando espesa puede hundirse hacia el fondo del recipiente.
Las células tienen varias formas, destacando entre ellas la forma cilindrica ovoidal o alargada, con unas dimensiones de (2 a 4) x (6 a 12) Jim, presentando a menudo una a dos granulaciones refringentes. En medios de cultivo, éste toma un color blanquecino, mate y de superficie ondulada.
Estas levaduras son las responsables de la enfermedad conocida como "flor de los vinos", desarrollándose un velo en su superficie en contacto con el aire, produciéndose una degradación de los ácidos fijos del vino, formándose ácido acético y acetaldehído de característico olor almendrado. El contenido el alcohol etílico es un factor limitativo para su desarrollo, siendo los 15 por 100 vol el valor máximo tolerable y también necesaria la presencia de aire.
- Género Hanseniaspora (Zikes): Son células de forma alimonada o apiculada, con unas dimensiones de (2 a 4) x (4 a 10) µm, se multiplican por gemación bipolar, y forman esporas semiesféricas en forma de sombrero, con 2 a 4 esporas por asea.
Estas levaduras se han encontrado en casi todos los frutos, siendo las primeras que aparecen en la uva cuando envera, y en la época de maduración representan casi la totalidad de la población aislada, razón por la cual son conocidas como levaduras "salvajes". Poseen un débil poder fermentativo, iniciando por lo tanto el proceso de la fermentación alcohólica, presentando la forma esporógena en zonas de clima caliente, mientras que en las frías se manifiestan las no esporógenas (Kloeckera).
Son levaduras capaces de desdoblar azúcares hasta 4 a 6 por 100 vol de alcohol, y con un rendimiento azúcar/alcohol bastante bajo, además de producir cantidades importantes de acidez volátil y también de acetato de etilo, razón por la cual su presencia en las fermentaciones no es deseada. Puede ser fácilmente eliminada del medio fermentativo, mediante sulfitados moderados, pues son muy poco resistentes al mismo; o bien realizar una fermentación "supercuatro", que consiste en arrancar la fermentación alcohólica con un 4 por 100 vol de alcohol por mezcla del mosto o la vendimia con vino elaborado. Sin embargo, algunos autores consideran que su presencia aumenta la complejidad aromática de los vinos, por la formación de ésteres de carácter aromático y afrutado.
- Género Kloeckera (Janke): Es la forma no esporógena del género Hanseniaspora.
- Género Hansenula (Sydow): Las levaduras del género Hansenula se reproducen por gemación múltiple y también por esporulación con 1 a 4 esporas por asca. Se diferencian de las del género Pichia, por la posibilidad de asimilar a los nitratos; pudiendo ambas formar un velo en la superficie del vino, produciendo cantidades importantes de acetato de etilo y algo menos de ácido acético, por lo que se las considera como levaduras indeseables.
La especie más conocida es la Hansenula anómala, que posee células de forma oval o globosa, con unas dimensiones de (4 a 10) x (3 a 4) µm, presentándose aisladas o en grupos de varias unidades y a veces encadenadas. Sus esporas, cuando son visibles, tienen forma semiesférica en sombrero. Poseen un débil poder fermentativo hasta 4 a 5 por 100 vol de alcohol, pudiendo multiplicarse sobre la superficie del sombrero durante la fermentación de los tintos, así como también en la superficie del vino y paredes de los recipientes que lo contienen.
- Género Kluyveromyces (van der Walt): Estas levaduras se diferencian de las del género Saccharomyces, por la forma de sus esporas y su tendencia a aglutinarse cuando se rompe el asca, y por sus necesidades en factores de crecimiento. Presentan formas variadas y se multiplican por gemación. La especie más conocida es Kluyveromyces thermotolerans, que presenta células redondeadas cuando son jóvenes, aisladas o agrupadas por pares, y con unas dimensiones de (3 a 6) x (4 a 8) µm. En un medio de cultivo se observa un característico halo o anillo circular.
Estas levaduras no suelen intervenir frecuentemente en las fermentaciones espontáneas de las vendimia, debido a su lenta multiplicación y a su bajo poder fermentativo. A pesar de estos inconvenientes, presentan un cierto interés enológico, por formar en su actividad fermentativa grandes cantidades de ácido láctico, del orden de 1,5 a 1,8 gramos/litro frente a 0,2 gramos/litro en las Saccharomyces, y pequeñas de ácido acético; estando consideradas como levaduras "acidificantes" cuando se utilizan asociadas a otras de mejor carácter fermentativo, y muy indicadas para vendimias producidas en zonas cálidas.
- Género Metschnikowia (Kamienski): Estas levaduras son más conocidas bajo el nombre de Candida pulcherrima, con células elípticas de dimensiones (3 a 7) x (4 a 8) µm. Multiplicada en un medio de cultivo sólido, forma una masa lisa, de aspecto húmedo y de color crema. Fermentan únicamente la glucosa de los mostos. La especie Metschnikowia pulcherrima puede producir un pigmento marrón rojizo que lo diferencia del medio.
- Género Pichia (Hansen): Este género incluye numerosas especies, habiéndose incluido recientemente en el mismo la mayoría de levaduras del género Hansenula. Sus células son ovaladas alargadas, en cadenas alargadas y a veces ramificadas, con unas dimensiones de (2 a 4) x (3 a 17) µm. En medio líquido se desarrolla rápidamente un velo, desprendiendo un característico olor a acetato de amilo, de carácter oxidativo y con formación de acidez volátil, siendo considerada como una levadura indeseable.
- Género Saccharomyces (Meyen y Reess): Estas levaduras son las principales responsables de la fermentación alcohólica de los mostos, incluyendo especies como S. cereviasiae con elevado poder fermentativo, vigorosas y resistentes al etanol y dióxido de azufre. Pero a pesar de su competitividad fermentativa no presentan gran difusión ambiental, y en el mosto y principalmente en la uva es generalmente minoritaria respecto a otras especies. Las células tienen formas variadas: ovaladas, redondas y alargadas, con tamaños también diferentes de (3 a 10) X (5 a 12) µm. Se multiplican por gemación múltiple, y forman esporas redondeadas u ovaladas, conteniendo un asea generalmente de una a cuatro esporas.
Son capaces de fermentar casi todos los azúcares, excepto los de cinco átomos de carbono, produciendo la enzima invertasa, capaz de desdoblar la sacarosa en glucosa y fructosa aproximadamente en partes iguales, y no asimilan los nitratos. Debido a los numerosos cambios acontecidos en la clasificación y nomenclatura de las levaduras del género Saccharomyces, es interesante aclarar que en la actualidad determinados epítetos añadidos a S. cereviasiae como cerevisiae, bayanus, uvarum, etc., utilizados frecuentemente por los enólogos, no están completamente de acuerdo con las especies admitidas por los taxonomistas. Tal es el caso de la S. bayanus, siendo una especie distinta de la S. cerevisiae, mientras que para los enólogos la S. bayanus designa a una raza fisiológica (r.f.) de S. cerevisiae incluida así en la antigua clasificación de Kreger von Rij (1984), que no fermenta la galactosa y posee una mayor resistencia al etanol que la S. cerevisiae r.f. cerevisiae, lo que puede generar una cierta confusión al elaborador de vinos. A pesar de lo dicho, a continuación se describen algunas levaduras del género Saccharomyces, de acuerdo con un criterio de clasificación anterior al actual. - Saccharomyces bailii (Lindner): Esta especie agrupa a las Saccharomyces acidifaciens y Saccharomyces elegans. Es bastante resistente al anhídrido sulfuroso, por lo que puede ocasionar en vinos dulces problemas de refermentaciones, metabolizando más rápidamente la fructosa que la glucosa. Se la encuentra de manera muy abundante, sobre los materiales de la bodega, especialmente en los envases y más fácilmente si éstos son de madera.
- Saccharomyces bayanus (Saccardo): Especie muy similar a la Saccharomyces oviformis, se diferencia por los siguientes caracteres, tales como poseer una forma más alargada, desarrollar una fermentación más lenta, precisar una mayor cantidad de nutrientes, y ser la levadura de mayor resistencia al alcohol y de alto poder alcohógeno. Esta última propiedad la hace ser muy indicada para fermentaciones difíciles, especialmente en finales de fermentación de vendimias muy ricas en azúcares, o bien para reiniciar una fermentación paralizada, o para la toma de espuma en la segunda fermentación de los vinos espumosos.
Actualmente se la encuentra agrupada dentro del género Zygosaccharomyces. - Saccharomyces cerevisiae (Hansen): También conocida como Saccharomyces ellipsoideus, es la especie de levaduras que desarrolla la mayor parte de la fermentación alcohólica, dominando rápidamente el medio fermentativo y dejando al resto de las levaduras como meras colaboradoras en proceso de elaboración de los vinos. Una vez terminada la fermentación, también desaparece con rapidez, siendo otras especies más resistentes al alcohol y al anhídrido sulfuroso, las responsables de posibles refermentaciones de los azúcares residuales.
- Saccharomyces oviformis (Osterwalder): Actualmente asimilada a la especie Saccharomyces bayanus, es la levadura que resiste la presencia de alcohol, así como de alto poder alcohógeno, pudiendo en ocasiones llegar a desdoblar hasta 18 por 100 vol de alcohol. También es muy resistente al anhídrido sulfuroso, siendo responsable las refermentaciones de los vinos dulces, pero también posee interesantes propiedades para el completo acabado de las fermentaciones difíciles.
- Saccharomyces uvarum (Beijerinck): Comprende la especie Saccharomyces carlsbergensis, es una levadura de desarrollo lento y poder alcohógeno medio, no comunicando a los vinos característica particular alguna, salvo que posee la propiedad de formar durante la fermentación cantidades apreciables de anhídrido sulfuroso.
- Género Saccharomycodes (Hansen): La única especie de este género es Saccharomycodes ludwigii, presenta células apiculadas de gran tamaño, algunas alargadas por los extremos, y con dimensiones de (4 a 7) x (8 a 23) µm. Se suelen encontrar en mostos o vinos fuertemente sulfitados, debido a que poseen una gran resistencia a este antiséptico, y producen en algunas ocasiones refermentaciones sobre los azúcares residuales, gracias a un singular mecanismo de acción: se desarrollan agrupadas, multiplicándose en la parte interior de la colonia, gracias a que las células exteriores en contacto con el medio forman importantes cantidades de acetaldehído, el cual se combina con el dióxido de azufre y lo inactiva como antiséptico. Cuando el nivel de anhídrido sulfuroso desciende, entonces la refermentación se produce con las levaduras dispersas en el medio.
También son levaduras "acetógenas" capaces de producir cantidades notables de acetato de etilo, del orden de 80 a 200 mg/litro, y sobre todo en el caso de condiciones de anaerobiosis. Producen vinos agrios y de olor desagradable, estando por lo tanto consideradas como levaduras patógenas indeseables.
- Género Schizosaccharomyces (Lindner): Sus células tienen una forma cilindrica o elíptica muy característica, con sus extremos redondeados y de dimensiones de (3 a 5) X (6 a 20) µm, reproduciéndose por escisión y nunca por gemación. Forman esporas generalmente en número de 2 a 4 alineadas dentro del asca. Dentro de este género se incluyen tres especies: Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus y Schizosaccharomyces japonicus.
Presentan un buen poder alcohógeno, aunque fermentan lentamente los azúcares, siendo poco competitivas respecto de las levaduras del género Saccharomyces, por lo que es necesario disponer de una importante población en el medio si se desea su participación. Son resistentes al alcohol y también frente al dióxido de azufre, encontrando a 30° C su temperatura óptima de desarrollo. Pero su principal característica, es el importante metabolismo de ácido málico, transformándolo en alcohol etílico y anhídrido carbónico, logrando una importante desacidificación del mosto y reduciendo el nivel del ácido málico muy inestable desde el punto de vista biológico. Esta actividad es conocida como "fermentación maloalcohólica".
- Género Torulaspora (Lindner): Células esféricas o elipsoidales de dimensiones (3 a 6) X (3 a 6) µm. Se reproducen por gemación multilateral y forman esporas conteniendo de 1 a 4 por asca. La especie más importantes es Torulaspora delbrueckii, antiguamente denominada S. rosei. Interviene en etapas intermedias de la fermentación, presentando buenas características enológicas, aunque es poco tolerante al alcohol.
- Género Zygosaccharomyces (Barker): Células esféricas, elipsoidales o alargadas, de dimensiones (3 a 7) x (4 a 11) µm. Se reproducen por gemación multilateral y forma de 1 a 4 esporas por asca. Son levaduras osmotolerantes, con una buena actividad fermentativa, haciéndolo preferentemente la fructosa respecto de la glucosa. Las especies más extendidas son Z. bailii, antes denominada S. bailli, y Z. fermentad.
- Género Rhodotorula: Células esféricas, ovoides o alargadas, con unas dimensiones de (2 a 4) x (3 a 10) µm. Producen un pigmento carotinoide que le confiere el color rosáceo. No son levaduras fermentadoras, por lo que desaparecen con el inicio de la fermentación alcohólica. Las especies más importantes aisladas de las vendimias o mostos son Rh. glutinis y Rh. minuta.
Fuente: Escrito por Jose Hidalgo Togores - Tratado de Enología