Fermentación alcohólica sin células de levadura*
Eduard Buchner
Hasta ahora no se había conseguido separar la acción fermentativa de las células vivas de levadura. Se describe a continuación un procedimiento que resuelve el problema.
Para obtener levadura desecada limpia, todavía sin diluir en almidón de patata, se mezcla y luego se tritura un kilogramo de levadura de cerveza1 con el mismo peso de arena de cuarzo2 y 250 gramos de polvo silíceo, hasta que la masa está húmeda y moldeable. Se añade a la pasta 100 gramos de agua y se la coloca en una prensa, en la que se la va sometiendo paulatinamente desde una presión de 4 hasta 500 atmósferas; se obtienen 300 centímetros cúbicos de jugo. La masa restante vuelve a triturarse, se filtra y se le añade 100 gramos de agua; sometida de nuevo en la prensa hidráulica a la misma presión, se obtienen otros 150 centímetros cúbicos de jugo. Así pues, de un kilogramo de levadura se consiguen 500 centímetros cúbicos de jugo, que contienen en torno a 300 de sustancias celulares. Para evitar un enturbamiento residual, el jugo se agita finalmente con 4 gramos de tierra silícea y se filtra con papel de filtro, vertiendo varias veces la primera parte.
El jugo así obtenido es un líquido amarillo claro, sólo opalescente, con agradable olor a levadura. Su peso específico a 17° C es de 1.0416. Con la cocción se produce un intenso precipitado de coágulos, de forma que el líquido se solidifica casi completamente; la formación de grumos insolubles comienza a los 35–40°, observándose antes la apari- ción de burbujas, que se ha comprobado que son de anhídrido carbó- nico y que después llenan todo el líquido3. El jugo contiene más del 10 % de sustancia seca. En otro obtenido anteriormente con un procedi- miento menos perfeccionado, se encontró 6.7 % de sustancia seca,
1.15 % de cenizas y, como estimación del contenido nitrogenado, 3.7 % de albúmina.
La característica de mayor interés del jugo es que fermenta los hidratos de carbono. Al mezclarlo con el mismo volumen de una solución concentrada de azúcar de caña, entre un cuarto de hora y una hora comienza la formación regular de anhídrido carbónico, que dura todo el día. Lo mismo sucede con el azúcar de uva, de fruta y de malta; por el contrario, no aparece ningún fenómeno fermentativo al mezclar el jugo con azúcar concentrado de leche o con una solución de manitol, ya que ambas tampoco son fermentadas por células vivas de levadura de cerveza. Las mezclas de jugo y de solución azucarada que están en fermentación varios días en la nevera se enturbian lentamente, sin que aparezcan microorganismos; por el contrario, con 700 aumentos se observan coágulos de albúmina bastante numerosos, cuyo precipitado está probablemente condicionado por los ácidos resultantes de la fermentación. La impregnación con cloroformo de la mezcla del jugo y la solución de sacarosa no inhibe la fermentación, pero conduce pronto a un descenso del precipitado de la albúmina. Tampoco anula la fuerza fermentativa el filtrado del jugo con un filtro de Berkefeldt de polvo silíceo, que retiene con seguridad todas las células de levadura; la mezcla del líquido filtrado, completamente claro, con una solución esterilizada de azúcar de caña conduce también a la fermentación, aunque con retraso, al cabo de un día aproximadamente, incluso a la temperatura de la nevera. Al colocar un tubo de papel pergamino lleno de jugo en una solución al 37 % de azúcar de caña, la superficie del tubo se cubre, al cabo de unas horas, de numerosas y minúsculas burbujas; por supuesto, en su interior se observa también una activa producción de gas, consecutiva a la difusión de la solución de azúcar. Experiencias posteriores decidirán si el vehículo de la fuerza fermentativa puede atravesar efectivamente, como parece*, el papel pergamino. La capacidad fermentativa del jugose va perdiendo lentamente con el tiempo; el jugo mantenido cinco días en agua helada en frascos a medio llenar carece de actividad ante la sacarosa. Es notable, en cambio, que el jugo diluído con azúcar de caña, es decir, con actividad fermentativa, conserve dicha actividad al menos dos semanas. Debe pensarse ante todo en una influencia favorable del anhídrido carbónico producido por la fermentación en el oxígeno del aire; no obstante, el azúcar fácilmente asimilable puede contribuir también al mantenimiento del agente.
Para obtener conclusiones acerca de la naturaleza de la sustancia activa del jugo, se han realizado hasta ahora solamente unos pocos experimentos. Al calentar el jugo a 40–50° apareció primero la produc- ción de anhídrido carbónico y luego, paulatinamente, el precipitado de la albúmina coagulada; al cabo de una hora, se filtró, con vertidos reiterados. En un experimento, el líquido filtrado claro conservaba aún una escasa fuerza fermentativa para el azúcar de caña, mientras que en otro había desaparecido; en consecuencia, ya a esta baja temperatura, la sustancia activa parece perder su acción o coagularse y desaparecer. Posteriormente se disolvieron 20 centímetros cúbicos del prensado en el triple volumen de alcohol absoluto, aspirando luego el poso y secándolo al vacío con ácido sulfúrico; quedaron 2 gramos de sustancia seca, que volvieron a ser diluídos al máximo en 10 centímetros cúbicos de agua. El filtrado carecía de acción fermentativa ante el azúcar de caña. Estos experimentos tienen que ser repetidos; en especial hay que intentar aislar la sustancia activa mediante el sulfato amónico.
Para la teoría de la fermentación pueden sacarse hasta el momento las siguientes conclusiones. En primer término, se ha comprobado que para producir el proceso fermentativo no es necesaria una estructura tan complicada como la célula de levadura. Como vehículo de la acción fermentativa del jugo hay que pensar más bien en una sustancia soluble, sin duda un cuerpo albuminoide, que debe ser denominado zimasa.
La idea de que un cuerpo albuminoide específico que se desarrolla en la célula de levadura produce la fermentación fue ya expuesta en 1858 por Moritz Traube como teoría enzimática o fermentativa y, más tarde, ha sido defendida sobre todo por Felix Hoppe-Seyler. Sin embargo, la separación de tal enzima de la célula de levadura no se había conseguido hasta ahora.
Resulta todavía hoy problemático si la zimasa debe incluirse entre las enzimas conocidas desde hace mucho tiempo. Existen importantes diferencias entre la acción fermentativa y las de las enzimas habituales, como ha puesto de relieve Carl von Naegeli4. Estas últimas son meras hidrólisis que pueden ser reproducidas con medios químicos sencillos. Aunque Adolf von Baeyer5 ha contribuido a que entendamos mejor el proceso de la fermentación alcohólica, explicándolo con principios químicos relativamente sencillos, la disgregación del azúcar en alcohol y anhídrido carbónico continúa perteneciendo a las reacciones químicas complejas; en ella se separan los enlaces del carbono de una forma tan completa que no se consigue por otro medio. También en la producción de calor hay una diferencia significativa6.
La invertina puede extraerse con agua de las células de levadura muertas por el calor seco (una hora a 150°) y aislarse por precipitación en alcohol en forma de un polvo muy soluble en agua. De este modo no puede obtenerse la sustancia con actividad fermentativa. En las células de levadura calentadas a tan alta temperatura no se encuentra en absoluto; del experimento antes expuesto puede deducirse que por precipitación en alcohol se convierte en otra sustancia insoluble en agua. En consecuencia, apenas cabe duda de que la zimasa pertenece a las sustancias albuminoides genuinas y que está mucho más cerca del proto- plasma vivo de las células de levadura que la invertina.
Parecidos puntos de vista ha manifestado el bacteriólogo francés Miquel en relación con la urasa, enzima segregada por las bacterias de la llamada fermentación de la urea; la considera simplemente como protoplasma que, privado de la protección de la membrana celular, actúa fuera de la misma, diferenciándose únicamente por ello del contenido celular7. También están relacionados con el tema los experimentos de E. Fischer y P. Lindner8 relativos a la acción del hongo de levadura Monilia candida sobre el azúcar de caña. Este hongo fermenta la sacarosa; sin embargo, ni Ch. E. Hansen ni los autores citados han conseguido extraer con agua de esta levadura fresca o desecada una enzima del tipo de la invertina que produzca dicho proceso en el azúcar de uva y en el de la fruta. Completamente distinto fue el resultado del experimento cuando Fischer y Lindner utilizaron levadura de Monilia fresca, fragmentando parte de las células mediante una cuidadosa trituración con polvo de cristal. La acción catalizadora de la hidrólisis no se produjo entonces. “Por lo demás, el agente no parece ser en este caso una enzima estable soluble en agua, sino un componente del protoplasma vivo.”
La fermentación del azúcar por la zimasa puede producirse en el interior de la célula de levadura9; sin embargo, las células de levadura probablemente segregan este cuerpo albuminoide en la solución de azúcar en la que producen fermentación10. En la fermentación alcohó- lica hay quizá que entender el proceso como una acción puramente fisiológica, ya que son las células de levadura vivas las que segregan la zimasa. Naegeli11 y O. Löw han indicado que, a 30° y a partir de las 15 horas, de las células de levadura salen por diósmosis considerables cantidades de sustancias albuminoideas coagulables por el calor a una solución nutritiva, que al principio reacciona de forma débilmente alca- lina (con PO4K3) y luego es neutra. De hecho, la zimasa atraviesa también el papel pergamino, como indica el experimento antes expuesto.
Experimentos sobre la fermentación
N°
|
Jugo
CC
|
Sol.
Hidrato de Carbono
|
CC
|
Contenido
azúcar %
|
Temperatura
experimental
|
Observaciones
|
1
|
30
|
Sacarosa
|
30
|
37
|
Nevera
|
Al
cabo de una hora, clara producción de gases, que no había
terminado a las 14 horas. Capa de espuma de 1 cm de espesor
|
2
|
50
|
”
|
50
|
37
|
”
|
Fuerte
producción de gases y capa de espuma. La solución, clara al
principio, se hizo opalescente a los 3 días, sin que hubiera
precipitado.
|
3
|
150
|
”
|
150
|
37
|
”
|
Capa
de espuma de 3/4 cm de espesor a los 3 días
|
4
|
20
|
”
|
20
|
37
|
”
|
La
producción de gases apareció a las 2 horas y no había cesado a
los 14 días. El líquido, claro al principio, presentaba al
final solamente un mínimo enturbiamiento. Capa de espuma de 1.5
cm de espesor.
|
5
|
30
|
”
|
30
|
37
|
”
|
La
producción de gases comenzó al cabo de un día y no había
terminado en una semana. La solución era entonces completamente
clara.
|
6
|
20
|
”
|
20
|
37
|
Temp.
ambiente
|
Producción
intensa de gases al cabo de un día; a las dos semanas de
mantenía un poco con un enturbiamiento mínimo.
|
7
|
20
|
”
|
20
|
37
|
40°
|
A
las dos horas, una capa de espuma de 10 cm de espesor; al cabo de
un día, intensa formación de coágulos y final de la formación
de gases.
|
8
|
30
|
”
|
30
|
12
|
Nevera
|
A
los 6 días de mantenía una intensa producción de gases; por
otra parte, enturbiamiento consistente de coágulos finamente
divididos.
|
9
|
5
|
Maltosa
|
5
|
33
|
”
|
Al
cabo de una hora, comienzo de la producción de gases, que
mantenía a los 12 días.
|
10
|
10
|
”
|
5
|
26
|
”
|
La
producción de gases era ya extraordinariamente intensa a las 3
horas.
|
11
|
10
|
Glucosa
|
10
|
33
|
”
|
La
producción de gases inició a las 20 horas, pero se mantenía a
los 12 días. Capa de espuma de 3/4 cm de espesor.
|
12
|
10
|
”
|
10
|
26
|
”
|
A
la media hora, producción de gases bastante intensa, que se
mantuvo 12 días. La solución se enturbió y presentaba algo de
sedimento.
|
13
|
10
|
Fructosa
|
10
|
37
|
”
|
La
producción de gases era ya muy intensa a la media hora y se
mantuvo activa 3 días. La solución se conservó clara.
|
14
|
10
|
”
|
10
|
25
|
”
|
La
capa de espuma era visible a los 15 minutos y alcanzó 1 cm de
espesor a los 3 días.
|
15
|
10
|
Lactosa
|
10
|
Sol.
saturada
|
Temp.
ambiente
|
No
se produjeron gases, ni siquiera a los 6 días
|
16
|
10
|
Manita
|
10
|
”
|
”
|
Igual
que la lactosa
|
Notas
En el experimento 1, el gas producido se condujo a agua caliza a las tres horas del comienzo de su aparición, siendo identificado como anhídrido carbónico. En los números 2 y 3, se determinó a los tres días el alcohol formado por la fermentación: había 1.5 gramos de alcohol etílico en el número 2 y 3.3 gramos en el número 3; de aquí hay que descontar las cantidades que tenía la levadura utilizada, procedentes de la preparación de la cerveza. En el número 2, la levadura, antes de obtener el jugo, fue lavada cuatro veces con 5 litros de agua en cada una; luego se determinó el alcohol en 2/3 del total, utilizándose el resto para el jugo; según los resultados, había en la levadura utilizada 0.3 gramos de alcohol como máximo. En el número 3, para la obtención del jugo mediante prensado, se utilizó directamente levadura de cerveza comercial depurada pero sin concentrar; el contenido alcohólico de la levadura necesaria para obtener 150 centímetros cúbicos de jugo era, de acuerdo con la correspondiente determinación, de 1.2 gramos. Por consiguiente, en el número 2 se produjo por la fermentación 1.2 gramos de alcohol y 2.1 en el número 3. En todos los casos se identificó el alcohol mediante la reacción yodofórmica, separándolo luego con potasa de la solución acuosa. El precipitado obtenido en el número 3 se completó entre 79 y 81° (734 mm), siendo el líquido destilado incoloro, inflamable y con olor a alcohol etílico.
Se realizaron indagaciones microscópicas en los experimentos números 2 y 3 a los tres días, en el número 8 a los seis y en el número 9 a los doce de fermentación continuada del pequeño poso; en ninguno de los casos aparecieron microorganismos, sino únicamente coágulos albuminosos como causa del mayor o menor enturbiamiento. En el experimento número 3 se prepararon, además, seis placas de cultivo, tras interrumpirlo a los tres días de duración. En una ocasión se puso como siembra un centímetro cúbico de líquido en tres tubos con gelatina fluida de mosto de cerveza y, en otro, un centímetro cúbico en tres tubos con gelatina fluida de peptona de caldo de carne. A los seis días, había 11 colonias en una de las placas con gelatina de mosto, permaneciendo estériles las dos restantes; en tres con gelatina de peptona aparecieron al mismo tiempo de 50 a 100 colonias, que se licuaron. Teniendo en cuenta la considerable cantidad de fluido utilizado como siembra en estos experimentos, los resultados demuestran que la acción fermentativa no depende de microorganismos, lo que, por otra parte, se deduce de la rápida aparición de los fenómenos de la fermentación.
Por último, en los experimentos números 4 y 5, el jugo se pasó a través de filtros
esterilizados de Berkefeldt de polvo silíceo. En el número 5, la solución de azúcar de caña fue, además, esterilizada en un autoclave y la mezcla de ambos líquidos se manejó con todas las reglas preventivas de la asepsia.
El método expuesto ha resultado también adecuado para obtener el contenido de la células bacterianas, estando en curso de realización experiencias al respecto, incluso con bacterias patógenas, en el Instituto de Higiene, de Munich.
Tübingen, 9 de enero de 1897
Observaciones
*Comunicación preliminar, recibida el 11 de enero. Traducido de Ber. Dt. Chem.Ges. 30, 117–124 (1897) por José M. López Piñero.
1 Se quita el agua contenida en la superficie y a una presión de 25 atmósferas ya no expulsa más.
2 El polvo de cristal resulta poco adecuado, debido a su acción débilmente alcalina.
3 Los fisiólogos vegetales decidirán si este anhídrido carbónico tiene relación con el procedente de los procesos oxidativos respiratorios.
*Esta observación era retirado por Buchner y Rapp [Ber. Dt. Chem. Ges. 31, 209–217 (1898), pág. 213] [Nota del editor].
4 Theorie der Gährung (Teoría de Fermentación), München, 1879, pág. 15.
5 En estos Berichte, vol. 3, pág. 73.
6 Recientemente, A. Bouffard ha vuelto a determinar la producción de calor en la fermentación alcohólica por células germinales. Compt. rend. 121, 357.
7 En todo caso, hay que poner de relieve que la llamada fermentación de la urea, o disgregación de la urea en amoníaco y anhídrido carbónico, es muy diferente desde el punto de vista químico de los procesos fermentativos propiamente dichos, por lo que no es considerada por muchos autores como fermentación. Se trata de una simple hidrólisis, que se obtiene con agua a 120°.
8 En estos Berichte, vol. 28, pág. 3037.
9 Pueden considerarse posibles los procesos diosmóticos. Véase Naegeli, loc. cit., pág. 39.
10 Con ello se explican también seguramente los experimentos de J. de Rey-Paihade (Comptes rendues, vol. 118, pág. 201), que ha obtenido un débil extracto alcohólico con levadura fresca de cerveza, añadiendo un poco de azúcar de uva. Tras eliminar los microorganismos mediante filtrado con una bujía de Arsonval estéril, en este extracto con contenido de azúcar aparece espontáneamente anhídrido carbónico al agotarse el oxígeno.
11 Loc. cit., pág. 94. Estos experimentos han sido repetidos con los mismos resultados; únicamente se ha comprobado que se producían también con soluciones de sacarosa y de lactosa. Por lo tanto, los procesos de difusión no están asociados a la actividad fermentativa, como suponen los autores citados.
Reprinted from New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge, pp. 33–40, ed. A. Cornish-Bowden, Universitat de València, Spain, 1997