Manual para microtorpes de cultivo de levaduras en pendientes de gelatina, criotubos y estárteres

Manual para microtorpes de cultivo de levaduras en pendientes de gelatina, criotubos y estárteres 1

(Gu ́ıa resumida)

Ver. 4.2.

Asociacion de Cerveceros Caseros Españoles (ACCE)

http://cerveceros-caseros.org/

14 de octubre de 2015

1 Extraído de ”El cultivo de levadura usando pendientes de gelatina”, David Draper, traducido por Antonio M. Mart ́ınez. Ampliado y mejorado en ACCE.

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Material de laboratorio

Recomendamos el material del proveedor Labbox, ya que tiene precios interesantes y dispone de todo lo necesario.
Material de Laboratorio (Labbox)

Código Labbox   Descripción

STUN-T04-100    Tubos de ensayo

TTSP-060-001    Gradilla para tubos de ensayo

KOLS-200-001    Mango de Kolle y astas de sembrado

ALBN-100-001    Lámpara de alcohol o Bunsen

BKT3-100-012    Vaso forma alta 100 ml

BKL3-500-006    Vaso forma baja 500 ml

FUS3-050-012    Embudo rama corta 50 mm

Nota: Los código de artı́culos enlazan con la web de Labbox.

Material de uso común
Además, necesitaremos otro material de uso común:

• Guantes de latex
• Pañuelos cleanex y alcohol 96 %, o en su defecto,
• Pulverizador (de los chinos) con disolución de 7 partes de alcohol
• 96 % y 2.5 partes de agua (preferentemente destilada).
• Mascarilla de laboratorio.

Y en cuanto a ingredientes:

• Gelatina de la que venden en tiendas de alimentación (alternativa, utilizar agar-agar).
• 15 gr. de extracto seco de malta.
• 1 sobre de levadura lı́quida.
• Olla grande, preferible a presión.

Además, si partes de un sobre de levadura lı́quida y pretendes hacer un estárter, o bien, partes del estárter, necesitarás todos los chismes para el manejo del estárter (matraz, agitador, varilla magnética, etc.)

Proceso
Para preparar las pendientes de gelatina (15-20 viales):

1. Lleva a ebullición 250 ml de agua.
2. Retira del fuego.
3. Añade 15 gr. de extracto seco de malta.
4. Agita hasta disolución total.
5. Vuelve a colocar el cazo en el fuego y hierve unos 5-10 minutos.
6. Retira del fuego.
7. Añade el sobre de gelatina.
8. Agita hasta la disolución total de la gelatina.
9. Rellena los viales necesarios con la ayuda de un embudo (hasta 1/3 de la capacidad aprox.).
10. Reserva 1 vial con gelatina para uso posterior (pendiente-auxiliar).
11. Reserva 1 vial vacı́o para uso posterior (vial-levadura)

Proceso

Para esterilizar el material:

1. Coloca en la olla todos los viales (incluı́dos pendiente-auxiliar y vial-levadura) Cierra los viales con los tapones, pero sin apretar, sólo una vuelta.
2. Esteriliza durante 20 minutos. Recuerda, mejor en olla a presión
3. Apaga el fuego.
4. Deja enfriar hasta 40o C.
5. Termina de apretar los tapones
6. En este momento, todo está esterilizado.
7. Coloca los tubos en la gradilla.
8. Pon la gradilla en un ángulo 40-45 grados, de forma que se extienda la gelatina a largo del vial, formándose la denominada pendiente.
9. Déjalos enfriar durante 24 horas.

Proceso
... pasadas 24 horas...

Inoculación de pendientes

1. Para preparar la disolución de levadura:
2. Prepara todo el entorno de trabajo: lámpara, pendientes,
3. pendiente-auxiliar, vial-levadura, levadura lı́quida y matraz.
4. Higieniza todo el entorno de trabajo, pulverizando con la disolución
5. de alcohol: mesa, mango, astas, tubos (exterior), manos con guantes.
6. Agita bien el sobre de levadura.
7. Pulveriza la zona de apertura del sobre.
8. Enciende la lámpara, y manipula en un radio de 10 cm.
9. Ponte la mascarilla, o en su defecto, aguanta la respiración.
   (Sin respirar).

• Abre el sobre de levadura.
• Vierte una pequeña cantidad en el vial-levadura.
• Vierte el resto del sobre en el matraz.
• Tapa el vial-levadura.
• Tapa el matraz. 

(Respira, ¡¡no se te olvide!!)

Inoculación de pendientes

Cultivar la levadura en el vial:

1. Ponte la mascarilla, o en su defecto, aguanta la respiración.
2. Enciende la lámpara, y sitúa todos los viales junto a ella. Recuerda, debes manipular en un radio de 10 cm.
3. Quita el tapón a vial-levadura y pendiente-auxiliar.
4. Repite el siguiente paso para cada uno de los viales a inocular:

(Sin respirar)

• Quita el tapón a un vial con pendiente de gelatina.
• Pon el asta al rojo vivo en la lámpara de alcohol.
• Introduce el asta en vial-auxiliar para enfriar (hará un psssssss, tranquilo, no pasa nada!!)
• Introduce el asta en vial-levadura para coger células de levadura.
• Ahora inoculamos la pendiente, mediante un leve zig-zag del asta, arañando la superficie de la gelatina. Intenta abarcar la mayor superficie posible.
• Retira el asta.
• Cierra vial con la pendiente de gelatina inoculado.

(Respira)

Para finalizar las pendientes
Una vez inoculados todos los viales:

1. Deja los viales a temperatura ambiente (aprox. 20 o C) durante una semana.
2. A los dos dı́as, podrás observar una pelı́cula blanquecina en la superficie de la pendiente.
3. Pasados unos dı́as, será una capa lechosa de 1 mm. de espesor.
4. Atención con el CO2 generado. Periódicamente abre ligeramente el tapón, para que salga el CO2.
5. Pasada una semana, encinta los tapones de los viales (tapando la junta entre el tapón y el vial).
6. Identifica tus viales inoculados: levadura, fecha, lote, ...
7. Conserva tus viales en el frigorı́fico.
8. A partir de este momento, tus pendientes están preparadas para ser utilizadas, vertiéndolas directamente en el estárter.

Preparando un estárter de levadura
Aviso!!

• Los volúmenes y tiempos que se ponen a continuación son orientativos, podrán variar dependiendo de cada cervecero
• La idea consiste en ir aumentando poco a poco el estárter de forma que la colonia dominante siempre sean nuestras levas y por tanto, minimicemos la probabiliadd de contaminación.
• No es tan importante el volumen de mosto como el tiempo de agitación (aireación) que será el que propage las levaduras.

Muy importante!!

• Destacamos la importancia de una buenga agitación en el matraz, con un vórtice que toque el fondo y se produzca una buena difusión de burbujas por todo el matraz

Preparando un estárter de levadura

• Prepararemos 1L de estárter para 25L de mostro y 2L de estárter para 50L de mosto.
• Para poder tener suficiente levadura desde una pendiente para 1L ó 2L es necesario el pasar por diversos pasos intermedios.

¿Por qué los estárters?

• En una pendiente de gelatina NO hay suficientes células para fermentar un batch, por ello necesitamos incrementar el no de células que inocularemos en el mosto.

• El proceso consistirá, tanto para el estárter 1L como 2L, inocular el volumen procedente de la pendiente, y en un periodo de 5 dı́as, incrementar el volumen de estárter, duplicando cada dı́a el volumen, aproximadamente.

Estárter 1L
Material necesario

• Dos Erlenmeyer de 125ml
• Un Erlenmeyer de 250ml
• Un Erlenmeyer de 500ml
• Un Erlenmeyer de 2litros
• Tapones y air-locks (o embudos de seguridad) para los Erlenmeyer
• Una olla lo suficientemente grande como para sanitizar los Erlenmeyer

Receta mosto para estárter 1L

• En el Erlenmeyer de 2l añade 700ml de agua y ponlo en el agitador a velocidad alta.
• Vierte lentamente 100gr de extracto suave seco de malta. Agitación.
• Para el agitador, añade hasta 1l. Agitación.

Estárter 1L
Sigue el planning, utilizando el Erlenmeyer y volúmenes apropiados. En cada etapa se añade al cultivo anterior, salvo la primera, que partimos de la pendiente. Sigue las pautas de laboratorio habituales.
Planning

• Martes: Erlenmeyer 125ml. 5ml. Inocula la cepa.
• Miércoles: Erlenmeyer 125ml. 15ml. (Total: 20ml)
• Jueves: Erlenmeyer 250ml. 60ml. (Total 80ml)
• Viernes: Erlenmeyer 500ml. 240ml. (Total 320ml)
• Sábado: Erlenmeyer 2l. 680ml. (Total 1l)

• El tiempo óptimo de cultivo de cada etapa es 18-24 horas. Agitación continua.

• Después de usar cada chisme, debe de esterilı́zarlo de forma habitual.
  Guarda los frascos, una vez frı́os, hasta que los necesites.

Estárter 2L
Material necesario (adicional a estárter 1L)

• Un Erlenmeyer de 4l

Receta mosto para estárter 2L

• Utiliza el Erlenmeyer 4l.
• Obtén 2l de mosto siguiendo el procedimiento para estárter 1L, con las cantidades de agua y extracto apropiados, manteniendo las proporciones.

Estárter 2L
Sigue el planning, utilizando el Erlenmeyer y volúmenes apropiados. En cada etapa se añade al cultivo anterior, salvo la primera, que partimos de la pendiente. Sigue las pautas de laboratorio habituales.

• Planning
• Martes: Erlenmeyer 125ml. 5ml. Inocula la cepa.
• Miércoles: Erlenmeyer 125ml. 20ml. (Total: 25ml)
• Jueves: Erlenmeyer 250ml. 100ml. (Total 125ml)
• Viernes: Erlenmeyer 500ml. 375ml. (Total 500ml)
• Sábado: Erlenmeyer 2l. 1500ml. (Total 2l)

• El tiempo óptimo de cultivo de cada etapa es 18-24 horas. Agitación continua.

• Después de usar cada chisme, debe de esterilı́zarlo de forma habitual.
  Guarda los frascos, una vez frı́os, hasta que los necesites.

Estárter 1L/2L (recomendaciones)
Recomendaciones

• En cada etapa utilizar un frasco de al menos 3 veces el tamaño del contenido para reducir la posibilidad sobre espumación y se contamine.
• Para las etapas que pueden tender a la sobreespumación (normalmente la 5a etapa) puedes tapar el frasco para evitar contaminaciones.
• Para las etapas que tiendan a sobreespumarse coloca un pequeño plato de aluminio sobre el agitador para recoger la espuma y que no lo manche.
• El Erlenmeyer de 125ml es un tamaño muy pequeño. Puede ser que en la primera etapa, el agitador no trabaje convenientemente. Si es posible convendrı́a el que adquirieras un Erlenmeyer de 50ml para la primera etapa, mejor que el de 125ml.

Estárter ⇒ criotubo

Material de Laboratorio (Labbox)

Código Labbox  Descripción
CRTP-R18-500   Criotubos con tapón de rosca2
FBXP-100-001   Caja de plástico congelable para 100 criotubos
MPIA-005-005   Pipetas 5mL
EAS8-010-001   Aspirador pipetas

Para la esterilización criotubos:

1. Llena los criotubos al 50 % de glicerina
2. Ponlos en la olla/autoclave en posición vertical con el tapón a una vuelta de rosca
3. Esteriliza
4. Abre la olla y termina de cerrar los criotubos

2 Alternativa: caja 50 criotubos premium-line (CRTD-018-050)

Estárter ⇒ criotubo

1. Esterilizar tubo de ensayo y pipeta
2. Extraer de matraz y llenar tubo de ensayo
3. Guardar al frı́o en posición vertical

Pasadas 24/48 hoas
Inoculación criotubos:

1. Esterilizar material y establecer lugar de trabajo: puertas/ventanas cerradas, lámpara/mechero encendido, mascarilla, etc.
2. Para Eliminar con pipeta most sobrante de tubo dejando 5 ml por encima de levadura decantada.
3. Cerrar tubo y agitar
4. Aspirar con pipeta y depositar en criotubo
5. Cerrar bien, agitar y colocar en congelador

Recomendación

• Sembrar dos criotubos por cada levadura para tener copia de seguridad en caso de accidente.

Criotubo ⇒ pendiente

• Suponemos las pendientes de gelatina ya conformadas

Inoculación pendientes:

1. Establecemos lugar de trabajo estéril: puertas cerradas, lámpara/mechero encendido, mascarilla, etc.
2. Agitar bien criotubo
3. Con la lámpara de alcohol, calentar al rojo asta de sembrado.
4. Introducir asta en criotubo
5. Sembrar haciendo zig-zag en pendiente de gelatina
6. Cerrar criotubo y pendiente
7. Depositar pendientes a temperatura ambiente
8. Volver a depositar criotubo en congelador

FAQS (Frequently Asked questions) I

¿Cuánto duran las pendientes inoculadas?
Meses. Yo he utilizado alguna pendiente con más de 1 año, y sin problemas.

¿Y los criotubos?
Años.

¿De dónde viene el término ’pendiente’?
Al poner la gelatina dentro del tubo y dejarlo enfriar en posición inclinada, cuando se solidifica se queda la gelatina en pendiente dentro del tubo.

¿Debo de apretar los tapones de los tubos ’hasta el infinito y más allá’?
No. De lo contrario los deformarás y probablemente pases la rosca.

¿Para qué es la glicerina en los criotubos?
Para evitar que se congelen las levaduras, en cuyo caso, morirı́an.

¿Por qué es conveniente utilizar el material que aparece en el documento?
Si pretendes participar en el intercambio de levaduras, es conveniente, ya que de lo contrario nos juntaremos con viales de diferentes tamaños/tipos.

FAQS (Frequently Asked questions) II

... y el agitador... ¿dónde está?
Deberás conseguirlo por tus medios. En breve, lo incluiremos en este documento.

He recibido unos pendientes por correo, y han llegado derretidas. ¿Están estropeadas?
En principio NO, lo único que ha ocurrido es que han estado expuestos a temperatura alta y se han derretido, pero las levaduras deben de estar mezcladas con la gelatina.

Si quiero evitar que se derritan las pendientes, ¿tengo alguna otra opción?
Si, utilizar agar-agar.

¿Por qué hacemos estárter a partir de pendiente y no directamente de criotubo?
Por varias razones, la principal porque es conveniente hacer un cultivo (pendiente) previo al estárter, para asegurarnos la levadura está sana.
Además de que la glicerina verterla al estárter...mirar sus composición y encontraréis la explicación.

FAQS (Frequently Asked questions) III

¿Obligatoriamente debo utilizar extracto seco?
Tienes alternativa: por ejemplo, un minimacerado de 1 kg. de malta base pilsen en 6 L de agua, obtendrás aprox. 5 L de mosto DI 1030, hervimos, dejamos enfriar en la nevera para que decanten mucho las proteı́nas, al dı́a siguiente, cambiamos de recipiente y envasamos en tarritos pequeños (según gustos), a continuación los tarritos se esterilizan al baño Marı́a.
Tendrás tarritos para aburrir, que irás abriendo para tus pendientes y estárteres según necesidad.